子癇前期（Preeclampsia, PE）是一種影響3%-7%妊娠的嚴(yán)重妊娠期并發(fā)癥，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和胎兒發(fā)病及死亡的主要原因之一。根據(jù)發(fā)病時(shí)間，PE可分為早發(fā)型（妊娠34周前）和晚發(fā)型。早發(fā)型PE病情更為嚴(yán)重，以血壓升高和蛋白尿?yàn)樘卣鳎�且無法完全預(yù)防。滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足、子宮螺旋動(dòng)脈重鑄障礙、胎盤功能障礙和內(nèi)皮功能紊亂是早發(fā)型PE的主要病理特征。

自噬（Autophagy）是一種基本的生物過程，負(fù)責(zé)細(xì)胞成分的降解和循環(huán)利用。在妊娠早期，自噬在胚胎發(fā)生和正常胚胎發(fā)育中扮演關(guān)鍵角色。然而，在缺氧條件下，自噬會加速滋養(yǎng)細(xì)胞衰老，加劇其功能障礙。臨床研究表明，LC3B介導(dǎo)的自噬在PE發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。PE孕婦胎盤及缺氧條件下的滋養(yǎng)細(xì)胞中自噬水平上調(diào)，提示抑制自噬可能成為PE的潛在治療策略。然而，自噬在PE滋養(yǎng)細(xì)胞中的確切作用及其觸發(fā)因素尚不清楚。

腫瘤抑制蛋白p53結(jié)合蛋白2（TP53BP2）基因編碼的蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中起主要作用。內(nèi)源性TP53BP2具有損傷誘導(dǎo)性，可調(diào)節(jié)涉及多種細(xì)胞功能的生理損傷反應(yīng)通路。近期研究發(fā)現(xiàn)，TP53BP2在多種腫瘤中過表達(dá)，是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因子。此外，TP53BP2通過其N端結(jié)構(gòu)域（與ATG12和LC3具有高度結(jié)構(gòu)相似性）調(diào)控自噬。研究表明，TP53BP2在低濃度gp120下抑制自噬，而在高濃度gp120下誘導(dǎo)自噬，提示其調(diào)控自噬具有濃度依賴性。鑒于滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲受損和螺旋動(dòng)脈重鑄不全是PE的主要原因，TP53BP2的異常表達(dá)和雙重功能使其可能通過調(diào)控自噬參與PE發(fā)病。

胎盤形成過程中的異常DNA甲基化是與PE相關(guān)的最重要表觀遺傳因素。組蛋白修飾（如乙酰化）的改變也可導(dǎo)致PE發(fā)生。基因表達(dá)受DNA甲基化標(biāo)記或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)等多種因素調(diào)控。在組蛋白修飾中，組蛋白甲基化是一種復(fù)雜的表觀遺傳機(jī)制，可通過改變?nèi)旧�體結(jié)構(gòu)激活或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄。DNA甲基化通過抑制基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)，同時(shí)修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并與其他表觀遺傳修飾相互作用，實(shí)現(xiàn)更復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控。在哺乳動(dòng)物中，體細(xì)胞DNA甲基化模式主要由DNMT1活性決定。DNMT1與G9a之間的直接相互作用被認(rèn)為在DNA復(fù)制過程中協(xié)調(diào)DNA甲基化和H3K9甲基化。

轉(zhuǎn)錄因子E2F1是E2F家族成員，參與細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞分化和DNA修復(fù)的調(diào)控。證據(jù)表明，E2F1和/或E2F2與CpG島的特異性結(jié)合通過核小體耗竭保護(hù)基因免受從頭DNA甲基化。此外，在乳腺癌中，E2F1表達(dá)增加和E2F1結(jié)合基序的CpG羥甲基化共同誘導(dǎo)ESRP1表達(dá)。尋找異常的DNA（低/高）甲基化可能是發(fā)現(xiàn)與PE相關(guān)的新標(biāo)志物、預(yù)測和理解PE發(fā)展的合理途徑。

本研究收集了2017年至2021年間在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院接受剖宮產(chǎn)的85例孕婦胎盤組織。PE定義為妊娠20周后，兩次測量（間隔至少6小時(shí)）收縮壓（SBP）≥140 mmHg和舒張壓（DBP）≥90 mmHg，并伴有蛋白尿（≥0.3 g/24 h）。非PE妊娠志愿者（n=40）的胎盤作為對照。PE妊娠組（n=45）胎盤來自早發(fā)型PE（<34周）孕婦。排除標(biāo)準(zhǔn)包括多胎妊娠、胎兒先天性畸形或染色體異常、近期感染、抗磷脂抗體陽性、創(chuàng)傷、妊娠期藥物或酒精濫用、妊娠20周前高血壓、有PE病史的血栓形成傾向、抗凝/抗聚集治療史、吸煙以及產(chǎn)科檢查數(shù)據(jù)不完整。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)使用斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague-Dawley, SD）大鼠（13-14周齡）。通過手術(shù)誘導(dǎo)子宮灌注壓降低（RUPP）建立PE模型。在妊娠第14天（GD14），大鼠在戊巴比妥麻醉下接受RUPP手術(shù)。簡言之，切開腹腔暴露腹主動(dòng)脈下端，在髂動(dòng)脈分叉上方放置銀夾（0.203 mm）使主動(dòng)脈血流減少約40%。同時(shí)在子宮弓的卵巢端用銀夾（0.100 mm）減少雙側(cè)子宮動(dòng)脈的卵巢側(cè)支循環(huán)程度。假手術(shù)組接受相同操作但不放置銀夾。構(gòu)建攜帶TP53BP2短發(fā)夾RNA（shRNA）、DNMT1 shRNA和G9a shRNA的重組腺相關(guān)病毒（AAV）血清型9載體，或攜帶陰性對照（AAV-shNC）的載體，將其注射入胎盤。在GD20處死大鼠，取出胎仔稱重，胎盤保存于-80°C備用。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)使用HTR-8/SVneo和JEG-3細(xì)胞系。細(xì)胞在含10%胎牛血清（FBS）和抗生素-抗真菌溶液的RPMI-1640或Ham's F-12培養(yǎng)基中，于37°C、5% CO₂條件下培養(yǎng)。為模擬嚴(yán)重缺氧，細(xì)胞在1% O₂、5% CO₂條件下培養(yǎng)48小時(shí)。使用重組腺病毒載體進(jìn)行TP53BP2、DNMT1、E2F1和G9a的過表達(dá)，或使用慢病毒載體進(jìn)行相應(yīng)基因的敲低。

為闡明早發(fā)型PE胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，研究人員通過RNA測序（RNA-seq）比較了早發(fā)型PE孕婦與非PE孕婦胎盤組織中自噬相關(guān)差異表達(dá)基因（DEGs）。功能相關(guān)基因主要富集在自噬相關(guān)信號通路，如磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt、AMPK和哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路。聚類熱圖顯示了PE胎盤自噬相關(guān)信號通路中前20個(gè)DEGs，其中TP53BP2是最強(qiáng)的誘導(dǎo)因子。與非PE孕婦相比，TP53BP2在PE孕婦胎盤中的表達(dá)顯著上調(diào)。免疫組織化學(xué)（IHC）和免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了TP53BP2在PE妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞中的上調(diào)。

為研究TP53BP2的功能，研究人員在HTR8/Svneo和JEG-3細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染Ad-TP53BP2或三種獨(dú)立的sh-TP53BP2構(gòu)建體進(jìn)行TP53BP2的過表達(dá)和敲低。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Ad-TP53BP2后，TP53BP2的mRNA和蛋白水平顯著增加。在三種獨(dú)立的sh-TP53BP2構(gòu)建體中，sh-TP53BP2 (#3)在兩種細(xì)胞系中均表現(xiàn)出最高的敲低效率，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用此構(gòu)建體。透射電子顯微鏡（TEM）結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Ad-TP53BP2的滋養(yǎng)細(xì)胞中自噬體和自噬溶酶體形成增加，而轉(zhuǎn)染sh-TP53BP2則出現(xiàn)相反效果。使用串聯(lián)熒光GFP-RFP-LC3的自噬流檢測顯示，轉(zhuǎn)染sh-TP53BP2的滋養(yǎng)細(xì)胞中總自噬體和自噬溶酶體形成減少。Western blotting分析證實(shí)了TP53BP2對缺氧條件下HTR8/SVneo和JEG-3細(xì)胞中LC3B-II和p62水平的影響。這些結(jié)果表明，TP53BP2上調(diào)可增加PE胎盤中的滋養(yǎng)細(xì)胞自噬。

基于體外研究結(jié)果，研究人員通過在GD14誘導(dǎo)大鼠RUPP建立PE模型，以研究TP53BP2的作用。使用攜帶TP53BP2 shRNA（AAV-shTP53BP2）的重組AAV9載體敲低PE大鼠的TP53BP2，導(dǎo)致血壓降低、蛋白尿減少和胎兒體重增加。蘇木精-伊紅（H&E）染色也顯示該大鼠模型中蛻膜細(xì)胞的水樣變性和纖維蛋白沉積減少。此外，TP53BP2下調(diào)的PE大鼠胎盤顯示LC3B-II表達(dá)降低和p62表達(dá)增加。免疫熒光染色和IHC染色結(jié)果一致。這些結(jié)果表明，TP53BP2敲低可減弱PE大鼠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬。

為探究自噬涉及的分子，研究人員對TP53BP2敲低的HTR8/SVneo細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq。結(jié)果顯示1046個(gè)分子上調(diào)和1035個(gè)分子下調(diào)。基因本體（GO）分析表明這些分子參與自噬、ATP結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、mTOR信號、HIF1信號通路和AMPK信號。qRT-PCR檢測前10個(gè)下調(diào)基因的水平，結(jié)果顯示自噬關(guān)鍵標(biāo)志物Beclin-1在PE大鼠胎盤中的水平顯著降低。

為確認(rèn)Beclin-1在TP53BP2誘導(dǎo)的自噬中的作用，研究人員構(gòu)建了三種獨(dú)立的sh-Beclin-1并轉(zhuǎn)導(dǎo)至HTR8/SVneo和JEG-3細(xì)胞。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)導(dǎo)sh-Beclin-1 (#1)后，Beclin-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著降低。共轉(zhuǎn)染sh-Beclin-1和Ad-TP53BP2導(dǎo)致HTR8/SVneo和JEG-3細(xì)胞中LC3B-II水平降低和p62表達(dá)增加。Bcl-2與自噬啟動(dòng)子Beclin-1相互作用。既往研究表明，Beclin-1從Bcl-2-Beclin-1復(fù)合物中釋放啟動(dòng)了TP53BP2誘導(dǎo)的自噬。本研究探討了Bcl-2與Beclin-1的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合在TP53BP2誘導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞自噬中的作用。CoIP顯示，在缺氧條件下，HTR8/SVneo和JEG-3細(xì)胞中TP53BP2與Bcl-2的相互作用增加，而Beclin-1與Bcl-2的相互作用被破壞。相反，TP53BP2敲低增加了Beclin-1與Bcl-2的相互作用。這些結(jié)果表明，TP53BP2敲低通過降低Beclin-1表達(dá)和促進(jìn)Beclin-1與Bcl-2的相互作用來抑制滋養(yǎng)細(xì)胞自噬。

為探討TP53BP2在PE進(jìn)展中的臨床意義，研究人員收集了85例早發(fā)型PE妊娠（<34周；n=45）和非PE妊娠（n=40）的胎盤。兩組在孕產(chǎn)婦年齡或胎兒性別上無顯著差異。然而，PE妊娠組的SBP、DBP和蛋白尿顯著升高。此外，PE妊娠組的孕產(chǎn)婦體重指數(shù)（BMI）顯著高于非PE妊娠組。與非PE妊娠相比，PE妊娠與分娩孕周（GAD）降低和新生兒出生體重（NBW）較低相關(guān)。為評估TP53BP2在胎盤功能障礙中的意義，分析了胎盤中TP53BP2與LC3B-II和p62的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在PE和非PE妊娠中，TP53BP2與LC3B-II水平呈正相關(guān)，與p62呈負(fù)相關(guān)。此外，胎盤TP53BP2水平與SBP、DBP和BMI呈正相關(guān)，與GAD和NBW呈負(fù)相關(guān)。ROC分析表明，TP53BP2診斷PE妊娠的曲線下面積（AUC）值最高，為0.882。因此，這些結(jié)果提示TP53BP2可能是與PE妊娠臨床病理特征相關(guān)的預(yù)測性生物標(biāo)志物。

首先，研究人員利用UCSC數(shù)據(jù)庫分析TP53BP2啟動(dòng)子的基因組序列，以評估表觀遺傳調(diào)控對其表達(dá)的影響。正如預(yù)期，TP53BP2啟動(dòng)子的CpG島含有高比例的GC堿基。MethPrimer程序識別出一個(gè)長1240 bp的單一CpG島，該島橫跨轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)-599至+641位置，CG含量為50%，CpG比率為0.6，位于TP53BP2的5′側(cè)翼區(qū)域遠(yuǎn)端，可能通過甲基化調(diào)控TP53BP2水平。

隨后，將TP53BP2的5′側(cè)翼區(qū)域的幾個(gè)片段插入熒光素酶載體pGL3中，熒光素酶活性測定結(jié)果顯示，片段-599/-35（涵蓋TP53BP2啟動(dòng)子大部分CpG二核苷酸）表現(xiàn)出最高的啟動(dòng)子活性。一致地，熒光素酶測定顯示，轉(zhuǎn)染含有片段-599/-35的pGL3熒光素酶報(bào)告基因后，HTR8/SVneo和JEG-3細(xì)胞中TP53BP2的轉(zhuǎn)錄活性增加，表明該區(qū)域是TP53BP2的核心調(diào)控區(qū)域。

為檢驗(yàn)DNA甲基化是否直接抑制TP53BP2啟動(dòng)子活性，研究人員從-599/-35克隆了TP53BP2近端啟動(dòng)子區(qū)域。使用甲基化酶SssI (M.SssI)、HhaI (M.HhaI)和HpaII (M.HpaII)對克隆的插入片段進(jìn)行甲基化。SssI用于甲基化所有51個(gè)5′-CpG-3′序列內(nèi)的CpG位點(diǎn)，HhaI僅甲基化9個(gè)5′-GCGC-3′序列內(nèi)的CpG位點(diǎn)，HpaII甲基化3個(gè)5′-CCGG-3′序列內(nèi)的CpG位點(diǎn)。通過用限制性內(nèi)切酶McrBC（甲基化特異性限制酶）、HhaI和HpaII（甲基化敏感限制酶）消化證實(shí)了片段的正確甲基化。將熒光素酶報(bào)告載體轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞后的熒光素酶測定顯示，三種甲基化酶處理均降低了TP53BP2啟動(dòng)子活性，其中SssI甲基化酶的抑制作用最顯著。

接下來，使用MSP檢測TP53BP2 DNA甲基化水平的差異。結(jié)果顯示，PE孕婦胎盤和缺氧條件下的滋養(yǎng)細(xì)胞中全局DNA甲基化水平降低。BSP進(jìn)一步顯示，在缺氧條件下，HTR8/SVneo細(xì)胞中TP53BP2啟動(dòng)子-599/-35區(qū)域內(nèi)的DNA甲基化水平顯著降低。這些結(jié)果表明，DNA低甲基化調(diào)控了PE妊娠胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中TP53BP2的轉(zhuǎn)錄激活。

為確定參與DNA甲基化的關(guān)鍵酶，研究人員在缺氧條件下用DC_05（DNMT1抑制劑）、茶黃素-3,3′-雙沒食子酸酯（TFD；DNMT3a抑制劑）或納米霉素A（NA；DNMT3b抑制劑）處理HTR8/SVneo細(xì)胞。結(jié)果顯示，DC_05處理（而非TFD或NA）導(dǎo)致缺氧條件下HTR8/SVneo細(xì)胞中TP53BP2啟動(dòng)子的DNA甲基化水平顯著降低。為進(jìn)一步確認(rèn)DNMT1在調(diào)控TP53BP2 DNA甲基化中的作用，研究人員通過轉(zhuǎn)導(dǎo)三種獨(dú)立的sh-DNMT1構(gòu)建體構(gòu)建了DNMT1敲低的HTR8/SVneo細(xì)胞。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)導(dǎo)sh-DNMT1 (#1)后，DNMT1的mRNA和蛋白表達(dá)顯著降低。結(jié)果表明，DNMT1敲低降低了TP53BP2啟動(dòng)子的DNA甲基化水平，并增加了TP53BP2的轉(zhuǎn)錄活性和蛋白水平。這些結(jié)果提示，DNMT1介導(dǎo)的DNA甲基化強(qiáng)烈抑制TP53BP2表達(dá)。

據(jù)報(bào)道，TP53BP2是E2F1的直接靶標(biāo)。本研究中，qRT-PCR和Western blotting檢測顯示，與非PE孕婦相比，E2F1在PE孕婦胎盤中的水平顯著增加。免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)。接下來，研究人員通過構(gòu)建E2F1過表達(dá)或敲低來檢測E2F1對TP53BP2表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Ad-E2F1后，E2F1的mRNA和蛋白水平顯著增加。在三種獨(dú)立的sh-E2F1構(gòu)建體中，sh-E2F1 (#3)在HTR8/Svneo細(xì)胞中表現(xiàn)出最高的敲低效率。E2F1過表達(dá)和敲低分別增加和抑制了缺氧條件下HTR8/SVneo細(xì)胞中TP53BP2的表達(dá)。

此外，使用抗E2F1抗體的ChIP assay顯示，在缺氧條件下，E2F1在TP53BP2啟動(dòng)子處顯著富集。接下來，研究人員使用JASPAR數(shù)據(jù)庫計(jì)算TP53BP2啟動(dòng)子中低甲基化CpG位點(diǎn)周圍的推定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。在TP53BP2啟動(dòng)子中鑒定出三個(gè)推定的E2F1結(jié)合位點(diǎn)（-33/-22, -99/-88, 和 -368/-357）。ChIP assay顯示E2F1與TP53BP2啟動(dòng)子在-33/-22, -99/-88, 和 -368/-357位點(diǎn)顯著結(jié)合。此外，熒光素酶報(bào)告基因測定顯示，突變-33/-22 (Mut1), -99/-88 (Mut2), 和 -368/-357 (Mut3)位點(diǎn)后，TP53BP2啟動(dòng)子的活性顯著降低。

甲基轉(zhuǎn)移酶可通過直接與轉(zhuǎn)錄因子相互作用調(diào)控靶基因表達(dá)。采用CoIP方法研究DNMT1與E2F1之間的關(guān)系。與先前報(bào)道一致，DNMT1在缺氧條件下的滋養(yǎng)細(xì)胞中與E2F1發(fā)生物理相互作用。此外，ChIP assay進(jìn)一步顯示，DNMT1敲低增加了E2F1在TP53BP2啟動(dòng)子處的富集。該結(jié)果表明DNMT1介導(dǎo)了E2F1與TP53BP2啟動(dòng)子的結(jié)合。總之，這些結(jié)果提示DNMT1抑制E2F1與TP53BP2啟動(dòng)子的結(jié)合，導(dǎo)致缺氧條件下滋養(yǎng)細(xì)胞自噬減少。

組蛋白修飾在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄中起重要作用。本研究利用UCSC基因組瀏覽器中的ENCODE組蛋白修飾軌道，鑒定了TP53BP2啟動(dòng)子區(qū)域的七種組蛋白修飾（H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3, H3K9me2, H3K9me3, H3K27me3 和 H3K36me3）。在這些組蛋白修飾中，H3K4me2和H3K4me3顯示出最多的富集峰。使用ChIP assay，研究人員檢測到在缺氧條件下，HTR8/SVneo細(xì)胞中H3K9me2在TP53BP2啟動(dòng)子處的富集顯著減少，而其他組蛋白修飾無此變化。免疫熒光染色顯示PE孕婦胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞中H3K9me2水平顯著降低。該結(jié)果證實(shí)了H3K9me2在PE妊娠滋養(yǎng)細(xì)胞TP53BP2轉(zhuǎn)錄中的重要性。

此外，通過測量幾種廣泛認(rèn)可的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（包括G9a、LSD1、SUV39H1和SUV39H2）的水平，研究人員檢測到PE孕婦胎盤和缺氧條件下的HTR8/SVneo細(xì)胞中G9a水平顯著降低。接下來，研究人員通過建立G9a敲低的HTR8/Svneo細(xì)胞來研究G9a對TP53BP2表達(dá)的影響。在三種獨(dú)立的sh-G9a構(gòu)建體中，sh-G9a (#3)在HTR8/Svneo細(xì)胞中表現(xiàn)出最高的敲低效率。體外實(shí)驗(yàn)顯示，G9a敲低顯著增強(qiáng)了缺氧條件下HTR8/Svneo細(xì)胞中TP53BP2的轉(zhuǎn)錄。類似地，用BIX-01294（G9a特異性抑制劑）處理增加了缺氧條件下HTR8/SVneo細(xì)胞中TP53BP2的水平。這些數(shù)據(jù)證明G9a可以抑制PE妊娠患者胎盤中TP53BP2的表達(dá)。

為闡明DNMT1和G9a在調(diào)控TP53BP2表達(dá)中的潛在關(guān)系，研究人員通過轉(zhuǎn)染Ad-DNMT1和/或Ad-G9a在HTR8/SVneo細(xì)胞中過表達(dá)DNMT1或G9a。DNMT1或G9a表達(dá)降低了E2F1與TP53BP2啟動(dòng)子的結(jié)合，而DNMT1和G9a共過表達(dá)進(jìn)一步減弱了這種結(jié)合。此外，G9a和DNMT1敲低顯著降低了缺氧條件下HTR8/SVneo細(xì)胞中TP53BP2的DNA甲基化水平和H3K9me2在TP53BP2啟動(dòng)子處的富集，最終導(dǎo)致TP53BP2轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)。在缺氧條件下用DC_05和/或BIX處理的HTR8/SVneo細(xì)胞中也觀察到類似結(jié)果。

值得注意的是，將AAV-shG9a和/或AAV-shDNMT1注射到PE大鼠胎盤后，H&E染色顯示胎盤損傷顯著增加。此外，注射AAV-shG9a和/或AAV-shDNMT1的PE大鼠顯示血壓和尿蛋白水平顯著升高，提示G9a和DNMT1在胎盤功能障礙中對E2F1與TP53BP2啟動(dòng)子結(jié)合的協(xié)同抑制作用。

接下來，研究人員研究了滋養(yǎng)細(xì)胞中E2F1、DNMT1和G9a之間的相互作用。CoIP assay顯示，在缺氧條件下，DNMT1與G9a和E2F1發(fā)生物理相互作用，而G9a與E2F1之間幾乎無相互作用。免疫熒光染色顯示，DNMT1和G9a與E2F1在HTR8/SVneo細(xì)胞核中共定位。

考慮到DNMT1的多功能結(jié)構(gòu)域，研究人員構(gòu)建了一系列DNMT1的截短構(gòu)建體，并將編碼不同GST標(biāo)記的DNMT1片段（GST-control, GST-WT, GST-1-446, GST-431-703, GST-643-835, GST-836-1060, 和 GST-1061-1632）的質(zhì)粒與編碼Myc標(biāo)記的G9a（Myc-G9a）或Flag標(biāo)記的E2F1（Flag-E2F1）的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中。CoIP assay顯示，DNMT1的1–446區(qū)域與G9a相互作用，而DNMT1的1061–1632區(qū)域與E2F1相互作用。

最重要的是，熒光素酶報(bào)告基因測定顯示，轉(zhuǎn)染Δ1–446突變的HTR8/SVneo細(xì)胞中TP53BP2轉(zhuǎn)錄活性顯著增加，而轉(zhuǎn)染Δ1061–1632突變則降低了其轉(zhuǎn)錄活性。此外，構(gòu)建了缺失與G9a（Δ1–446）或E2F1（Δ1061–1632）相互作用區(qū)域的DNMT1質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到HTR8/SVneo細(xì)胞中。有趣的是，刪除DNMT1的1–446區(qū)域顯著增加了缺氧條件下HTR8/SVneo細(xì)胞中E2F1在TP53BP2啟動(dòng)子處的富集，同時(shí)減少了DNMT1在TP53BP2啟動(dòng)子處的富集。相反，刪除DNMT1的1061–1632區(qū)域促進(jìn)了E2F1與TP53BP2啟動(dòng)子的結(jié)合，并增強(qiáng)了H3K9me2的富集。總之，這些結(jié)果表明G9a與DNMT1之間的相互作用抑制了E2F1介導(dǎo)的滋養(yǎng)細(xì)胞中TP53BP2的激活。

子癇前期（PE）是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和胎兒發(fā)病的主要原因，其病理與胎盤功能障礙和