《Advanced Science》：SIRT5–RAC2 Axis Drives Monocyte-to-Macrophage Differentiation to Promote Inflammatory Injury in Premature Ovarian Insufficiency
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本文揭示了SIRT5通過(guò)調(diào)控RAC2蛋白穩(wěn)定性促進(jìn)單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化的新機(jī)制，闡明了SIRT5–RAC2軸在卵巢免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)SIRT5缺失可減輕環(huán)磷酰胺（CTX）誘導(dǎo)的卵巢巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和顆粒細(xì)胞凋亡，為卵巢早衰（POI）的免疫治療提供了新靶點(diǎn)。
2.1 SIRT5缺陷減少卵巢巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)
為研究POI發(fā)病過(guò)程中卵巢微環(huán)境的免疫紊亂，研究團(tuán)隊(duì)首先建立了化療誘導(dǎo)的POI模型。8周齡雌性小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺（CTX，50 mg/kg）后，卵巢出現(xiàn)明顯功能障礙，表現(xiàn)為卵巢重量和卵泡儲(chǔ)備顯著減少，同時(shí)伴隨廣泛卵泡閉鎖。qRT-PCR分析顯示CTX處理顯著下調(diào)了卵泡發(fā)育關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子（包括顆粒細(xì)胞特異性基因Amh、Foxl2、Fshr以及卵母細(xì)胞特異性基因Gdf9），表明卵泡發(fā)育受損。同時(shí)，負(fù)責(zé)雌激素生物合成的顆粒細(xì)胞特異性酶Cyp19a1表達(dá)顯著降低，提示類固醇生成功能受損。
通過(guò)檢測(cè)免疫細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)CTX處理的卵巢中巨噬細(xì)胞標(biāo)志物Adgre1和Cd68顯著上調(diào)，而T細(xì)胞、漿細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞標(biāo)志物僅輕微增加。流式細(xì)胞術(shù)分析和免疫熒光染色進(jìn)一步證實(shí)巨噬細(xì)胞是CTX處理卵巢中最顯著擴(kuò)張的免疫群體。
對(duì)成人小鼠卵巢scRNA-seq數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，Sirt5表達(dá)在卵巢巨噬細(xì)胞和黃體細(xì)胞中高度富集，而在卵母細(xì)胞中表達(dá)可忽略不計(jì)。免疫熒光染色驗(yàn)證了SIRT5在F4/80+巨噬細(xì)胞中的強(qiáng)表達(dá)，這些巨噬細(xì)胞主要分布在AMH陽(yáng)性發(fā)育卵泡周圍的卵巢間質(zhì)中。
2.2 SIRT5缺陷破壞卵巢單核-巨噬細(xì)胞分化
為表征SIRT5缺失后卵巢巨噬細(xì)胞的分子和功能變化，研究團(tuán)隊(duì)對(duì)從對(duì)照和Sirt5?/?卵巢中FACS分選的F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞進(jìn)行了Smart-seq分析�；蚣患治鲲@示，在Sirt5?/?卵巢巨噬細(xì)胞中下調(diào)的基因顯著富集于M-CSF刺激下單核-巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄本。
為評(píng)估SIRT5在CSF1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分化中的功能作用，研究使用了兩種體外模型。在兩種模型中，單核-巨噬細(xì)胞分化過(guò)程中Sirt5mRNA水平均顯著上調(diào)。SIRT5缺失顯著損害了巨噬細(xì)胞分化，表現(xiàn)為經(jīng)典巨噬細(xì)胞標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄減少。免疫熒光進(jìn)一步證實(shí)CSF1處理后，Sirt5?/?單核細(xì)胞來(lái)源群體中F4/80+細(xì)胞比例降低。
2.3 SIRT5通過(guò)增強(qiáng)CSF1R信號(hào)促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞分化
機(jī)制探索發(fā)現(xiàn)，CSF1誘導(dǎo)的JAK2和AKT磷酸化在Sirt5?/?單核細(xì)胞中顯著降低。與體外發(fā)現(xiàn)一致，在巨噬細(xì)胞群體重建過(guò)程中，SIRT5缺陷單核細(xì)胞也表現(xiàn)出JAK/STAT和AKT信號(hào)激活受損。這些數(shù)據(jù)表明SIRT5通過(guò)維持JAK/STAT和PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)，對(duì)CSF1驅(qū)動(dòng)的卵巢微環(huán)境內(nèi)巨噬細(xì)胞分化是必需的。
2.4 SIRT5促進(jìn)卵巢微環(huán)境炎癥
為評(píng)估SIRT5缺陷引起的單核-巨噬細(xì)胞分化受損如何影響卵巢免疫穩(wěn)態(tài)，研究團(tuán)隊(duì)分析了Sirt5+/+和Sirt5?/?卵巢的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。基因本體和通路富集分析顯示差異表達(dá)基因顯著富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路。RNA測(cè)序和qRT-PCR驗(yàn)證均表明SIRT5缺陷顯著降低了多種巨噬細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子和趨化因子的mRNA表達(dá)，主要是促炎因子如Tnf、Il1b、Il1a、Cxcl9和Cxcl10。
2.5 SIRT5缺陷減輕CTX誘導(dǎo)的卵巢功能障礙
在CTX誘導(dǎo)的POI模型中，CTX暴露引起了單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞（Ly6C+F4/80+）的顯著擴(kuò)張。CTX處理還誘導(dǎo)了卵巢間質(zhì)中M1樣巨噬細(xì)胞的強(qiáng)烈增加，而M2樣巨噬細(xì)胞豐度基本不變。小鼠血清和卵巢組織的ELISA檢測(cè)顯示CTX處理顯著升高了促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β水平，卵巢組織中的積累高于循環(huán)系統(tǒng)。
值得注意的是，SIRT5缺陷顯著減輕了CTX誘導(dǎo)的卵巢單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞擴(kuò)張，導(dǎo)致M1巨噬細(xì)胞積累減少，TNF-α和IL-1β在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達(dá)降低。形態(tài)學(xué)上，SIRT5缺失也減輕了CTX誘導(dǎo)的卵巢重量損失，并部分保留了卵泡池。
2.6 SIRT5缺陷減輕 caspase依賴性顆粒細(xì)胞凋亡
免疫組化分析顯示，生長(zhǎng)卵泡中Ki67陽(yáng)性顆粒細(xì)胞減少，CTX處理的卵巢中cleaved Caspase-3染色顯著增加，表明顆粒細(xì)胞增殖減少和凋亡增強(qiáng)。TUNEL和衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。這些病理變化在CTX處理的SIRT5缺陷卵巢中顯著減輕，表明SIRT5缺陷減輕了CTX誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡和衰老，從而保護(hù)卵泡完整性。
2.7 SIRT5通過(guò)去琥珀�；�(wěn)定RAC2促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞分化
研究發(fā)現(xiàn)SIRT5缺陷或抑制其去琥珀酰酶活性導(dǎo)致RAC2蛋白水平顯著降低，而Rac2mRNA表達(dá)沒(méi)有相應(yīng)下降。免疫共沉淀和質(zhì)譜分析鑒定RAC2為SIRT5的新型琥珀酰化底物。SIRT5缺陷導(dǎo)致RAC2琥珀酰化增加，促進(jìn)其蛋白酶體降解，從而損害CSF1R驅(qū)動(dòng)的巨噬細(xì)胞分化。
2.8 MC3482藥理抑制SIRT5減輕CTX誘導(dǎo)的POI模型卵巢損傷
MC3482（SIRT5抑制劑）處理顯著改善了卵巢結(jié)構(gòu)，保留了卵泡池，表現(xiàn)為靜息卵泡和生長(zhǎng)卵泡數(shù)量增加，卵泡閉鎖減少。基因表達(dá)分析顯示MC3482處理恢復(fù)了卵泡發(fā)育和類固醇激素生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，同時(shí)降低了凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的表達(dá)。MC3482處理還顯著抑制了CTX誘導(dǎo)的卵巢巨噬細(xì)胞群體擴(kuò)張，降低了TNF-α和IL-1β在蛋白和mRNA水平的表達(dá)。
研究表明SIRT5–RAC2軸是卵巢免疫微環(huán)境的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，SIRT5通過(guò)去琥珀酰化穩(wěn)定RAC2蛋白，確保CSF1信號(hào)傳導(dǎo)的有效轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)單核-巨噬細(xì)胞分化。在化療誘導(dǎo)的卵巢損傷中，抑制SIRT5–RAC2軸可減輕巨噬細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的炎癥和顆粒細(xì)胞凋亡，為卵巢早衰的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)。
