《Advanced Science》：CRISPR-Cas9-Loaded Theranostic Liposomes for Enhancing Radiosensitization of Prostate Cancer through POLD4 Gene Editing under Real-Time MRI Monitoring
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本文報道了一種新型診療一體化基因遞送平臺（PIO@Lipo），通過CRISPR-Cas9系統靶向編輯前列腺癌中DNA聚合酶δ亞基4（POLD4）基因，并在超小型超順磁性氧化鐵納米顆粒（USPIONs）介導的磁共振成像（MRI）實時監測下，有效增強腫瘤放射敏感性。研究證實PIO@Lipo可誘導DNA損傷、促進細胞凋亡并重塑免疫抑制微環境，為克服前列腺癌放射抵抗提供了新策略。
探索新的放射增敏基因靶點
放射治療是局部進展性前列腺癌的基礎治療手段，但其療效常因DNA修復機制等因素介導的放射抵抗而受限。本研究通過對接受6 Gy照射的前列腺癌RM-1細胞進行轉錄組測序分析，鑒定出2969個差異表達基因（DEGs）。基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析顯示，這些基因顯著富集于細胞周期調控和DNA修復通路，包括錯配修復、同源重組修復等。值得注意的是，DNA聚合酶δ亞基4（POLD4）作為這些通路的共同調控組分，其表達在放療后顯著上調。生物信息學分析進一步證實POLD4在前列腺癌組織中的表達高于癌旁正常組織。POLD4是DNA聚合酶δ復合體的關鍵亞基，在DNA復制和修復中起核心作用。研究表明，POLD4敲低可增強淋巴瘤細胞對化療藥物喜樹堿的敏感性，且不影響正常細胞活力，提示其作為放射增敏靶點的潛力。
質粒與USPIONs共載脂質體的表征
為驗證POLD4的放射增敏作用，研究構建了五個靶向POLD4的CRISPR-Cas9質粒，并篩選出編輯效率最高的sgRNA3用于后續實驗。通過靜電相互作用，將CRISPR-Cas9質粒和USPIONs共同封裝于陽離子脂質體中，形成MRI可追蹤的基因遞送平臺（PIO@Lipo）。瓊脂糖凝膠阻滯實驗證實質粒在1:1質量比下被完全包裹，封裝效率達91.8%。動態光散射（DLS）顯示PIO@Lipo的水合粒徑為72.1–94.8 nm，多分散指數（PDI）為0.20–0.25。空脂質體（Lipo）的zeta電位為42.2 mV，負載USPIONs（IO@Lipo）后降至21.9 mV，進一步負載質粒（PIO@Lipo）后為15.4 mV。X射線光電子能譜（XPS）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）證實了USPIONs的成功摻入。透射電子顯微鏡（TEM）顯示USPIONs平均粒徑為4.5 ± 0.8 nm，PIO@Lipo呈膜結構形態，平均直徑72.9 nm，適于通過增強滲透和滯留（EPR）效應實現腫瘤靶向。脂質體組成中DSPE-PEG-NH2的比例調整為3%，以增強體內穩定性和抗污能力。
PIO@Lipo通過抑制腫瘤生長和誘導凋亡增強放療療效
細胞實驗分為六組：對照組（G1）、空脂質體組（G2）、IO@Lipo組（G3）、PIO@Lipo組（G4）、放療組（G5）及PIO@Lipo聯合放療組（G6）。CCK-8實驗顯示，PIO@Lipo在12 μg/mL濃度下將細胞活力降至45%。集落形成實驗表明，聯合治療組（G6）的集落數顯著減少至81個，呈現協同抗腫瘤效應。活/死染色和流式細胞術凋亡分析進一步證實，G6組晚期凋亡細胞比例達33.7%，顯著高于其他組。Western blot結果顯示，聯合治療組DNA損傷標志物γ-H2AX表達上調，促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降，表明線粒體凋亡通路被激活。qPCR結果在mRNA水平驗證了Bax和Bcl-2的表達變化。為確認POLD4的放射增敏作用，研究還構建了sgRNA抗性POLD4 cDNA質粒，發現恢復POLD4表達可減弱放射增敏效應，進一步證實POLD4是有效的放射增敏靶點。機制上，POLD4缺失導致復制叉崩潰，與放療引起的DNA斷裂協同作用，加劇基因組不穩定性。
PIO@Lipo的轉染效率及其對基因編輯通路的影響
通過質粒攜帶的EGFP報告基因評估轉染效率，共聚焦顯微鏡和流式細胞術顯示PIO@Lipo的轉染效率達49.2%，體內腫瘤組織轉染效率為14.9%。Sanger測序證實PIO@Lipo介導的POLD4基因編輯在體外細胞和體內腫瘤組織中均誘導了序列變異，Indel頻率分別為28%和10%。Western blot和qPCR分析顯示，聯合治療組POLD4表達顯著下調，同時ATM-CHK2通路活化，同源重組修復蛋白RAD51表達上調，表明DNA損傷反應被激活。溶酶體逃逸實驗顯示，PIO@Lipo在4小時部分共定位溶酶體，8小時后質粒成功進入細胞核。為評估脫靶效應，研究通過Cas-OFFinder工具預測了前6個潛在脫靶位點，Sanger測序和擴增子測序均未檢測到脫靶編輯，證實了CRISPR系統的高特異性。
PIO@Lipo的MRI性能及體內時間依賴性分布
體外MRI顯示PIO@Lipo在T1加權成像（T1WI）和T2加權成像（T2WI）中均具有對比增強能力，縱向弛豫率（r1）為2.8 mM-1s-1，橫向弛豫率（r2）為35.7 mM-1s-1。尾靜脈注射后，腫瘤部位在1小時出現明顯信號增強，4小時達到峰值，12小時基本恢復至基線水平。小動物活體成像系統（IVIS）和電感耦合等離子體光學發射光譜（ICP-OES）定量分析表明，PIO@Lipo在腫瘤組織中積累顯著高于游離質粒，4小時達到峰值，隨后逐漸被肝臟和脾臟清除。其高效腫瘤靶向歸因于適中的粒徑（~73 nm）、3%的PEG化修飾以及EPR效應。
PIO@Lipo的治療效果評估
動物實驗顯示，聯合治療組（G6）腫瘤體積顯著減小，小鼠體重穩定增加。Western blot證實腫瘤組織中POLD4表達下調，RAD51表達上調。腫瘤大體標本顯示G6組腫瘤顏色蒼白，提示血管生成抑制。組織病理學分析顯示，G6組Ki-67陽性細胞減少，HE染色見核固縮和碎片化，TUNEL檢測到大量凋亡細胞。這些結果表明PIO@Lipo聯合放療可有效抑制腫瘤增殖并誘導細胞凋亡。
PIO@Lipo介導的放療免疫調節及生物相容性
流式細胞術分析顯示，聯合治療組脾臟CD4+和CD8+T細胞比例顯著增加，腫瘤組織中M1型巨噬細胞（CD80+）比例上升，M2型巨噬細胞（CD206+）比例下降。ELISA檢測發現腫瘤組織內TNF-α、IFN-β和IFN-γ等抗腫瘤細胞因子水平升高，表明聯合治療誘導了免疫原性細胞死亡（ICD），并重塑了腫瘤微環境。血液生化指標和主要器官組織學檢查未發現明顯毒性，證實PIO@Lipo具有良好的生物相容性。
結論
本研究開發了一種MRI監控的基因治療平臺PIO@Lipo，通過CRISPR-Cas9系統靶向敲低POLD4基因，顯著增強了前列腺癌的放射敏感性。機制上，PIO@Lipo誘導DNA損傷、促進凋亡并調節免疫微環境。該策略為克服前列腺癌放射抵抗提供了新的治療思路。
