《Advanced Science》：CRISPR-Cas9-Loaded Theranostic Liposomes for Enhancing Radiosensitization of Prostate Cancer through POLD4 Gene Editing under Real-Time MRI Monitoring
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本文報道了一種新型診療一體化基因遞送平臺（PIO@Lipo），通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向編輯前列腺癌中DNA聚合酶δ亞基4（POLD4）基因，并在超小型超順磁性氧化鐵納米顆粒（USPIONs）介導(dǎo)的磁共振成像（MRI）實時監(jiān)測下，有效增強(qiáng)腫瘤放射敏感性。研究證實PIO@Lipo可誘導(dǎo)DNA損傷、促進(jìn)細(xì)胞凋亡并重塑免疫抑制微環(huán)境，為克服前列腺癌放射抵抗提供了新策略。
探索新的放射增敏基因靶點
放射治療是局部進(jìn)展性前列腺癌的基礎(chǔ)治療手段，但其療效常因DNA修復(fù)機(jī)制等因素介導(dǎo)的放射抵抗而受限。本研究通過對接受6 Gy照射的前列腺癌RM-1細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，鑒定出2969個差異表達(dá)基因（DEGs）。基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析顯示，這些基因顯著富集于細(xì)胞周期調(diào)控和DNA修復(fù)通路，包括錯配修復(fù)、同源重組修復(fù)等。值得注意的是，DNA聚合酶δ亞基4（POLD4）作為這些通路的共同調(diào)控組分，其表達(dá)在放療后顯著上調(diào)。生物信息學(xué)分析進(jìn)一步證實POLD4在前列腺癌組織中的表達(dá)高于癌旁正常組織。POLD4是DNA聚合酶δ復(fù)合體的關(guān)鍵亞基，在DNA復(fù)制和修復(fù)中起核心作用。研究表明，POLD4敲低可增強(qiáng)淋巴瘤細(xì)胞對化療藥物喜樹堿的敏感性，且不影響正常細(xì)胞活力，提示其作為放射增敏靶點的潛力。
質(zhì)粒與USPIONs共載脂質(zhì)體的表征
為驗證POLD4的放射增敏作用，研究構(gòu)建了五個靶向POLD4的CRISPR-Cas9質(zhì)粒，并篩選出編輯效率最高的sgRNA3用于后續(xù)實驗。通過靜電相互作用，將CRISPR-Cas9質(zhì)粒和USPIONs共同封裝于陽離子脂質(zhì)體中，形成MRI可追蹤的基因遞送平臺（PIO@Lipo）。瓊脂糖凝膠阻滯實驗證實質(zhì)粒在1:1質(zhì)量比下被完全包裹，封裝效率達(dá)91.8%。動態(tài)光散射（DLS）顯示PIO@Lipo的水合粒徑為72.1–94.8 nm，多分散指數(shù)（PDI）為0.20–0.25。空脂質(zhì)體（Lipo）的zeta電位為42.2 mV，負(fù)載USPIONs（IO@Lipo）后降至21.9 mV，進(jìn)一步負(fù)載質(zhì)粒（PIO@Lipo）后為15.4 mV。X射線光電子能譜（XPS）和傅里葉變換紅外光譜（FTIR）證實了USPIONs的成功摻入。透射電子顯微鏡（TEM）顯示USPIONs平均粒徑為4.5 ± 0.8 nm，PIO@Lipo呈膜結(jié)構(gòu)形態(tài)，平均直徑72.9 nm，適于通過增強(qiáng)滲透和滯留（EPR）效應(yīng)實現(xiàn)腫瘤靶向。脂質(zhì)體組成中DSPE-PEG-NH2的比例調(diào)整為3%，以增強(qiáng)體內(nèi)穩(wěn)定性和抗污能力。
PIO@Lipo通過抑制腫瘤生長和誘導(dǎo)凋亡增強(qiáng)放療療效
細(xì)胞實驗分為六組：對照組（G1）、空脂質(zhì)體組（G2）、IO@Lipo組（G3）、PIO@Lipo組（G4）、放療組（G5）及PIO@Lipo聯(lián)合放療組（G6）。CCK-8實驗顯示，PIO@Lipo在12 μg/mL濃度下將細(xì)胞活力降至45%。集落形成實驗表明，聯(lián)合治療組（G6）的集落數(shù)顯著減少至81個，呈現(xiàn)協(xié)同抗腫瘤效應(yīng)。活/死染色和流式細(xì)胞術(shù)凋亡分析進(jìn)一步證實，G6組晚期凋亡細(xì)胞比例達(dá)33.7%，顯著高于其他組。Western blot結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組DNA損傷標(biāo)志物γ-H2AX表達(dá)上調(diào)，促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3表達(dá)增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降，表明線粒體凋亡通路被激活。qPCR結(jié)果在mRNA水平驗證了Bax和Bcl-2的表達(dá)變化。為確認(rèn)POLD4的放射增敏作用，研究還構(gòu)建了sgRNA抗性POLD4 cDNA質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)恢復(fù)POLD4表達(dá)可減弱放射增敏效應(yīng)，進(jìn)一步證實POLD4是有效的放射增敏靶點。機(jī)制上，POLD4缺失導(dǎo)致復(fù)制叉崩潰，與放療引起的DNA斷裂協(xié)同作用，加劇基因組不穩(wěn)定性。
PIO@Lipo的轉(zhuǎn)染效率及其對基因編輯通路的影響
通過質(zhì)粒攜帶的EGFP報告基因評估轉(zhuǎn)染效率，共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)顯示PIO@Lipo的轉(zhuǎn)染效率達(dá)49.2%，體內(nèi)腫瘤組織轉(zhuǎn)染效率為14.9%。Sanger測序證實PIO@Lipo介導(dǎo)的POLD4基因編輯在體外細(xì)胞和體內(nèi)腫瘤組織中均誘導(dǎo)了序列變異，Indel頻率分別為28%和10%。Western blot和qPCR分析顯示，聯(lián)合治療組POLD4表達(dá)顯著下調(diào)，同時ATM-CHK2通路活化，同源重組修復(fù)蛋白RAD51表達(dá)上調(diào)，表明DNA損傷反應(yīng)被激活。溶酶體逃逸實驗顯示，PIO@Lipo在4小時部分共定位溶酶體，8小時后質(zhì)粒成功進(jìn)入細(xì)胞核。為評估脫靶效應(yīng)，研究通過Cas-OFFinder工具預(yù)測了前6個潛在脫靶位點，Sanger測序和擴(kuò)增子測序均未檢測到脫靶編輯，證實了CRISPR系統(tǒng)的高特異性。
PIO@Lipo的MRI性能及體內(nèi)時間依賴性分布
體外MRI顯示PIO@Lipo在T1加權(quán)成像（T1WI）和T2加權(quán)成像（T2WI）中均具有對比增強(qiáng)能力，縱向弛豫率（r1）為2.8 mM-1s-1，橫向弛豫率（r2）為35.7 mM-1s-1。尾靜脈注射后，腫瘤部位在1小時出現(xiàn)明顯信號增強(qiáng)，4小時達(dá)到峰值，12小時基本恢復(fù)至基線水平。小動物活體成像系統(tǒng)（IVIS）和電感耦合等離子體光學(xué)發(fā)射光譜（ICP-OES）定量分析表明，PIO@Lipo在腫瘤組織中積累顯著高于游離質(zhì)粒，4小時達(dá)到峰值，隨后逐漸被肝臟和脾臟清除。其高效腫瘤靶向歸因于適中的粒徑（~73 nm）、3%的PEG化修飾以及EPR效應(yīng)。
PIO@Lipo的治療效果評估
動物實驗顯示，聯(lián)合治療組（G6）腫瘤體積顯著減小，小鼠體重穩(wěn)定增加。Western blot證實腫瘤組織中POLD4表達(dá)下調(diào)，RAD51表達(dá)上調(diào)。腫瘤大體標(biāo)本顯示G6組腫瘤顏色蒼白，提示血管生成抑制。組織病理學(xué)分析顯示，G6組Ki-67陽性細(xì)胞減少，HE染色見核固縮和碎片化，TUNEL檢測到大量凋亡細(xì)胞。這些結(jié)果表明PIO@Lipo聯(lián)合放療可有效抑制腫瘤增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
PIO@Lipo介導(dǎo)的放療免疫調(diào)節(jié)及生物相容性
流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，聯(lián)合治療組脾臟CD4+和CD8+T細(xì)胞比例顯著增加，腫瘤組織中M1型巨噬細(xì)胞（CD80+）比例上升，M2型巨噬細(xì)胞（CD206+）比例下降。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)TNF-α、IFN-β和IFN-γ等抗腫瘤細(xì)胞因子水平升高，表明聯(lián)合治療誘導(dǎo)了免疫原性細(xì)胞死亡（ICD），并重塑了腫瘤微環(huán)境。血液生化指標(biāo)和主要器官組織學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)明顯毒性，證實PIO@Lipo具有良好的生物相容性。
結(jié)論
本研究開發(fā)了一種MRI監(jiān)控的基因治療平臺PIO@Lipo，通過CRISPR-Cas9系統(tǒng)靶向敲低POLD4基因，顯著增強(qiáng)了前列腺癌的放射敏感性。機(jī)制上，PIO@Lipo誘導(dǎo)DNA損傷、促進(jìn)凋亡并調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境。該策略為克服前列腺癌放射抵抗提供了新的治療思路。
