《Advanced Science》：Dual Aptamers-Based SETDB1 PROTACs as Effective Anti-Tumor Strategies for Breast Cancer
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本文報道了首個靶向SETDB1的PROTAC降解劑開發，通過SELEX技術篩選獲得高親和力SETDB1適配體，并與AS1411連接構建單鏈（AP-SETDB1-S6A）和部分雙鏈（AP-SETDB1-D2）PROTAC分子。實驗證實二者可特異性識別SETDB1并招募MDM2 E3連接酶，通過泛素-蛋白酶體途徑降解SETDB1，有效抑制乳腺癌細胞增殖、遷移并逆轉他莫昔芬耐藥性，同時增強CD8+T細胞的腫瘤殺傷能力。該研究為乳腺癌靶向治療提供了新型降解策略。
2.1 SETDB1蛋白ssDNA適配體的體外篩選
SETDB1作為組蛋白甲基轉移酶在多種癌癥進展中發揮關鍵作用。研究采用SELEX技術篩選靶向SETDB1串聯 Tudor結構域（TTDs）的ssDNA適配體。通過高通量測序獲得12個富集序列，其中C11適配體經ITC驗證具有最高親和力（Kd=0.682 μM）。細胞裂液pull-down實驗證實C11可特異性結合內源性SETDB1。進一步截短優化發現C11-2（28 nt）為最小功能單元，其親和力顯著提升（Kd=0.247 μM）。
2.2 靶向SETDB1的適配體基ssDNA PROTAC的合成與表征
將SETDB1適配體與核仁素靶向適配體AS1411通過多聚腺嘌呤（poly-A）連接子串聯，構建系列單鏈PROTAC。其中6A連接子構建的AP-SETDB1-S6A降解效果最優，且ITC驗證其保持SETDB1結合能力（Kd=0.896 μM）。Western blot顯示AP-SETDB1-S6A可劑量依賴性地降解MCF-7、T47D和MDA-MB-231細胞中的SETDB1，且在48小時內保持血清穩定性。值得注意的是，該降解作用對非腫瘤細胞MCF-10A無影響，體現腫瘤選擇性。
2.3 靶向SETDB1的適配體基部分dsDNA PROTAC的合成與表征
基于DNA自組裝特性，利用10 bp互補連接子構建三種部分雙鏈PROTAC（AP-SETDB1-D1/D2/D3）。其中AP-SETDB1-D2穩定性最佳，且對SETDB1的親和力進一步提高（Kd=0.321 μM）。該分子可直接穿透細胞膜，在多種乳腺癌細胞中實現SETDB1的劑量和時間依賴性降解，且不影響SETDB1轉錄水平。
2.4 AP-SETDB1-S6A和AP-SETDB1-D2通過泛素-蛋白酶體途徑誘導SETDB1降解
Streptavidin pull-down實驗證實兩種PROTAC均可同時捕獲SETDB1、NCL和MDM2，形成三元復合物。Co-IP實驗進一步驗證PROTAC處理增強了SETDB1與NCL-MDM2復合物的相互作用。敲低NCL或MDM2可顯著減弱SETDB1降解效果。蛋白酶體抑制劑MG132可完全阻斷降解過程，而自噬抑制劑CQ無此作用。Ubiquitination實驗顯示PROTAC處理顯著增強SETDB1泛素化修飾。
2.5 AP-SETDB1-S6A和AP-SETDB1-D2在細胞中展現抗腫瘤活性
MTT實驗表明兩種PROTAC可顯著抑制乳腺癌細胞活力。EdU摻入實驗和克隆形成實驗證實其抑制細胞增殖能力。傷口愈合和Transwell實驗顯示PROTAC處理顯著降低細胞遷移和侵襲能力。在他莫昔芬耐藥細胞系（MCF-7-TamR/T47D-TamR）中，PROTAC處理可降低IC50值，逆轉耐藥性。此外，AP-SETDB1-D2處理可增強CD8+T細胞對腫瘤細胞的殺傷作用（LDH釋放實驗）。
2.6 AP-SETDB1-S6A和AP-SETDB1-D2抑制小鼠乳腺癌生長
荷瘤小鼠模型顯示靜脈注射PROTAC（5 mg/kg）可靶向富集至腫瘤組織，顯著抑制腫瘤生長。免疫熒光證實腫瘤組織內SETDB1蛋白水平下降，增殖標志物Ki-67表達降低。重要器官組織學檢查未發現明顯毒性，表明PROTAC具有良好的體內安全性。
3 討論
本研究首次開發了靶向SETDB1的適配體基PROTAC降解劑。相較于傳統小分子抑制劑，PROTAC技術可通過催化方式降解目標蛋白，避免長期用藥產生的耐藥性。雙適配體設計巧妙利用AS1411的腫瘤靶向性，實現特異性遞送。部分雙鏈PROTAC（AP-SETDB1-D2）展現更優穩定性和降解效率。該策略為乳腺癌治療提供了新思路，并為其他難靶向癌蛋白的降解劑開發提供參考。
4 實驗方法
涵蓋蛋白質表達純化、SELEX篩選、SPR/ITC結合測定、細胞功能實驗（MTT、EdU、Transwell等）、動物模型建立及組織學分析等標準化實驗流程。所有統計數據分析均采用SPSS軟件處理，實驗重復3次以上。
