細(xì)胞色素P450在所有脊椎動物的類固醇激素生物合成中扮演著至關(guān)重要的角色[1]。其中，CYP17A1是一個關(guān)鍵角色，它負(fù)責(zé)催化從孕烯醇酮（PREG）和孕酮（PROG）到脫氫表雄酮和雄烯二酮的兩步轉(zhuǎn)化反應(yīng)，如圖1所示。這些反應(yīng)涉及C17位的羥基化，隨后是C17和C20碳原子之間的碳-碳鍵斷裂步驟[2,3]。重要的是，第二個反應(yīng)在細(xì)胞色素b₅（Cytb₅）存在下會顯著加速[[4], [5], [6]]。雖然第一個反應(yīng)是P450酶的典型反應(yīng)，通過化合物I（Cpd 1）驅(qū)動的氫抽提和氧回彈途徑進(jìn)行，但C-C裂解反應(yīng)的機(jī)制長期以來一直存在爭議。

比較CYP17A1催化的羥基化和C-C鍵斷裂反應(yīng)，揭示了顯著差異，例如不同的產(chǎn)物生成速率和偶聯(lián)效率（NADPH消耗與產(chǎn)物生成之比）、底物偏好（PROG vs. PREG）以及Cytb₅對裂解反應(yīng)的關(guān)鍵作用[7]。羥基化和裂解反應(yīng)之間的另一個重要差異體現(xiàn)在動力學(xué)溶劑同位素效應(yīng)（KSIE）的測量上。雖然前者顯示正常的KSIE（k_H/k_D> 1，符合質(zhì)子依賴性催化的預(yù)期），但后者觀察到反向的KSIE，即k_H/k_D< 1，這表明涉及不同的催化機(jī)制[[8], [9], [10]]。關(guān)于機(jī)制方面以及不同催化物種的參與，有研究支持過氧鐵催化的途徑[11,12]，也有研究反對它[13,14]，其中一項QM/MM研究傾向于前者[15]。其他涉及裂解催化的P450例子包括CYP19A1 [[16], [17], [18]], CYP51A1 [19,20], CYP199A4 [[21], [22], [23]], CYP2B4 [16]，關(guān)于主要催化物種是Cpd 1還是過氧鐵中間體的問題，得出了各種結(jié)論。總體而言，CYP17A1中C-C鍵斷裂催化的優(yōu)選途徑顯然取決于底物相對于鐵-氧中間體的定位，包括C17羥基基團(tuán)與Fe-OO和Fe-OO^?中間體的近端氧原子之間是否存在氫鍵，以及P450酶安排遠(yuǎn)端氧原子質(zhì)子化以形成Fe-OOH的能力。底物取向結(jié)果證明是最重要的因素，正如PREG和PROG之間的差異所表明的那樣。WT和N202S突變體CYP17A1的結(jié)構(gòu)和功能研究證明了這種底物定位的差異[24]。

所有哺乳動物細(xì)胞色素P450都通過單個N端跨膜螺旋與膜結(jié)合，F(xiàn)-G環(huán)和G'螺旋也參與蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用。其氧化還原伴侶黃素蛋白細(xì)胞色素P450還原酶（CPR）同樣通過一個跨膜螺旋與膜連接，細(xì)胞色素b₅也是如此。這些與膜的相互作用對P450酶及其氧化還原伴侶的相互取向施加了限制，從而穩(wěn)定了它們在功能上重要的電荷轉(zhuǎn)移復(fù)合物中的相互作用[25,26]。細(xì)胞色素P450和氧化還原伴侶的跨膜螺旋在脂質(zhì)雙分子層內(nèi)的相互作用在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)功能相互作用中起著至關(guān)重要的作用，這已被實驗[27]和分子動力學(xué)（MD）模擬[28,29]所證明。因此，用于人類細(xì)胞色素P450結(jié)構(gòu)和功能研究的重組系統(tǒng)應(yīng)基于使用脂質(zhì)膜整合蛋白，例如微粒體制備物、脂質(zhì)體、雙分子層盤或脂質(zhì)納米盤，因為這些系統(tǒng)保留了脂質(zhì)雙分子層在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用中的作用。對于納米盤而言，脂質(zhì)組成的精確控制和摻入膜的細(xì)胞色素P450的單體狀態(tài)提供了特征明確、結(jié)構(gòu)均一的穩(wěn)定制備物，可用于低溫光譜實驗[30,31]和用于詳細(xì)動力學(xué)測量的停流研究[[32], [33], [34], [35], [36], [37], [38]]，以及產(chǎn)物形成的穩(wěn)態(tài)動力學(xué)功能研究[9,10,[38], [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45]]。

與底物和抑制劑結(jié)合的CYP17A1的X射線結(jié)構(gòu)提供了定義底物相對于催化活性血紅素-氧中間體取向的功能重要相互作用的詳細(xì)圖像[[46], [47], [48]]。值得注意的是，N202側(cè)鏈通過與前者的C3-OH基團(tuán)和后者同一位置的酮基形成氫鍵，來調(diào)整PREG和PROG底物位置的作用被揭示出來。此外，17-羥基孕烯醇酮的位置在晶體中不同分子間略有不同，其中一些更靠近血紅素鐵，并且非常適合在C17羥基基團(tuán)和Fe-OO^?過氧中間體的近端氧之間形成氫鍵，這優(yōu)化了C-C鍵斷裂催化途徑上半縮酮中間體的形成[7,44]。

然而，迄今為止所有CYP17A1的結(jié)構(gòu)都是針對蛋白質(zhì)的三價鐵狀態(tài)獲得的，并且沒有氧合復(fù)合物的X射線結(jié)構(gòu)可用。正如CYP101A1所示[49,50]，細(xì)胞色素P450的還原和氧結(jié)合可能伴隨著微妙的局部構(gòu)象變化和水分子的出現(xiàn)，這可能對有效質(zhì)子傳遞以進(jìn)行催化非常重要。因此，關(guān)于底物相對于鐵-氧中間體的定位，以及氫鍵和質(zhì)子傳遞的直接結(jié)構(gòu)信息應(yīng)主要從各種光譜學(xué)研究在77 K冷凍溶液中低溫穩(wěn)定的P450催化中間體中獲得。

對裂解反應(yīng)替代催化途徑性質(zhì)的重要見解是通過測量動力學(xué)溶劑同位素效應(yīng)（KSIE）提供的。基于比較H₂O和D₂O緩沖液中酶催化速率的機(jī)制研究由Showen [51,52]和Cleland [53,54]引入，并針對質(zhì)子傳遞是限速步驟且對催化步驟至關(guān)重要的幾種酶進(jìn)行了描述。通常，這些反應(yīng)在H₂O中比在D₂O中更快，因為氘代水中D-O鍵的能量略高，因此質(zhì)子傳遞事件較慢。然而，對于某些反應(yīng)，觀察到反向的KSIE，即產(chǎn)物形成速率在D₂O中更快[55,56]。對此結(jié)果最直接的解釋是存在兩條途徑，其中一條需要溶劑水的質(zhì)子化，另一條則不依賴于質(zhì)子化。如果產(chǎn)物是在不需要質(zhì)子化的途徑上形成的，而質(zhì)子依賴性途徑是非生產(chǎn)性的，那么在這種系統(tǒng)中觀察到的產(chǎn)物形成速率在D₂O中將高于在H₂O中。酪氨酸羥化酶中觀察到了這樣的例子[55]。

對CYP17A1催化的C-C斷裂在17-羥基孕酮（17-OH PROG）和17-羥基孕烯醇酮（17-OH PREG）中的催化機(jī)制的KSIE分析，通過與在相同條件下由相同CYP17A1酶催化的羥基化反應(yīng)的可用KSIE測量結(jié)果進(jìn)行比較而得到補(bǔ)充。對于由Cpd 1催化的羥基化反應(yīng)，觀察到正常的KSIE，范圍在1.3–2.0，這與過氧鐵和氫過氧鐵中間體的兩個 obligatory 質(zhì)子化步驟（生成Cpd 1所必需的步驟）一致。對于CYP17A1及其幾種突變體催化的PREG和PROG的羥基化，也測量到了相同的正常KSIE [9,24,41,42,45,57]。然而，對于裂解反應(yīng)，總是觀察到反向的KSIE，無論使用17-OH PREG還是17-OH PROG，這表明存在替代的、不依賴于質(zhì)子化的催化途徑（圖2）。此外，反向KSIE不僅表明產(chǎn)物是通過替代的未質(zhì)子化催化中間體形成的，而且還表明Cpd 1途徑對17-羥基化裂解底物是非生產(chǎn)性的，并且它充當(dāng)了解偶聯(lián)通道。對于通過Cpd 1的這個非生產(chǎn)性通道，穩(wěn)態(tài)反應(yīng)通量在H₂O中由于更快的質(zhì)子化而顯著高于在D₂O中，因此生產(chǎn)性通道對總NADPH消耗的貢獻(xiàn)比例較小。在D₂O中情況則不同，通過Cpd 1質(zhì)子依賴性非生產(chǎn)性通道的通量較小，更多的產(chǎn)物通過不依賴于質(zhì)子的過氧鐵催化路徑形成。這種分配在我們最近的出版物[8]中進(jìn)行了詳細(xì)分析，我們表明實驗觀察到的反向KSIE與主要的Cpd 1催化的產(chǎn)物形成不兼容（圖3）。

CYP17A1中羥基化和裂解反應(yīng)不同催化機(jī)制的另一個有力證據(jù)來自對酸-醇對關(guān)鍵功能位點突變效應(yīng)的比較，該位點對P450酶功能中有效的質(zhì)子傳遞和Cpd 1形成至關(guān)重要[49,50,[58], [59], [60], [61], [62], [63], [64]]。E305G和T306A突變都顯著抑制了CYP17A1催化的PREG和PROG羥基化的產(chǎn)物形成速率，而C-C鍵斷裂速率相對不受影響[10,41,42]。這些位置突變的強(qiáng)烈抑制效應(yīng)對于許多以Cpd 1作為羥基化反應(yīng)主要催化物種的P450酶來說是常見的。CYP17A1催化的裂解反應(yīng)不受E305G和T306A突變的顯著影響這一事實，為支持不依賴于向鐵-氧中間體傳遞質(zhì)子的替代催化機(jī)制增添了更多證據(jù)。

證明CYP17A1催化的羥基化和裂解反應(yīng)機(jī)制差異的另一個實驗觀察是后者具有更強(qiáng)的pH依賴性。兩種反應(yīng)在pH 7.0時都比在pH 7.8時更快，但對于裂解反應(yīng)，pH依賴性在E305G突變體中更為明顯，以至于在pH 7.0時C-C斷裂變得顯著快于野生型CYP17A1。這是不尋常的，因為通常情況相反，羥基化反應(yīng)由于裂解步驟的更高解偶聯(lián)而相當(dāng)快。

CYP17A1催化的裂解反應(yīng)的一個非常重要的方面是其與細(xì)胞色素b₅相互作用的關(guān)鍵作用。先前研究表明，在缺乏Cytb₅的情況下，產(chǎn)物形成受到強(qiáng)烈抑制或根本檢測不到[4,[65], [66], [67], [68]]。細(xì)胞色素b₅作為氧化還原伴侶的作用歸因于第二次電子傳遞和加速氧合CYP17A1的還原，從而防止通過自氧化解偶聯(lián)NADPH氧化還原當(dāng)量[69,70]。Cytb₅相同的機(jī)制作用先前已通過停流和單周轉(zhuǎn)實驗[71,72]以及低溫光譜法[73]在CYP2B4中得到證明，并已有綜述[74]。Cytb₅的另一個可能貢獻(xiàn)是通過對CYP17A1中鐵-硫鍵的變構(gòu)效應(yīng)，這可能有利于催化[75]，或者通過影響底物相對于催化中間體的定位，盡管此類相互作用的細(xì)節(jié)目前尚不清楚。

正如首次在CYP2B4中所示，在還原型細(xì)胞色素b₅存在下，細(xì)胞色素P450的氧合復(fù)合物被還原為過氧鐵或氫過氧鐵中間體的速度顯著加快。將這些結(jié)果與單周轉(zhuǎn)實驗相結(jié)合，得出了細(xì)胞色素b₅在改善一般NADPH消耗與產(chǎn)物形成速率的偶聯(lián)比方面具有重要作用的整體現(xiàn)象學(xué)結(jié)論[65,70]。研究還表明CPR和Cytb₅競爭P450分子上的相同結(jié)合位點，盡管在CYP2B4 – 細(xì)胞色素b₅系統(tǒng)的這些研究中沒有嘗試對Cytb₅的作用進(jìn)行更詳細(xì)的機(jī)制解釋。

后來研究表明，Cytb₅參與向氧合CYP17A1有效傳遞第二個電子與那些CYP2B4研究相似，如在納米盤中使用停流光譜進(jìn)行實驗研究[69]。將飽和了17-OH PREG的還原型CYP17A1與還原型CPR或還原型細(xì)胞色素b₅共同摻入，并與氧飽和緩沖液混合，以監(jiān)測P450酶的快速氧結(jié)合，隨后是氧合復(fù)合物的消失。在沒有氧化還原伴侶的情況下，CYP17A1的自氧化速率在25°C時為0.02 s^?1，而從Cytb₅到氧合CYP17A1的電子傳遞速率約為0.9 s^?1，顯著快于從CPR的傳遞（約0.1 s^?1）。當(dāng)CPR和Cytb₅以等摩爾比例與CYP17A1共同摻入納米盤時，觀察到的氧合復(fù)合物消失速率為1.3 s^?1，表明在三元復(fù)合物中細(xì)胞色素b₅優(yōu)先相互作用且第二次電子傳遞更快。細(xì)胞色素b₅作為CYP17A1第二個電子供體的功能能力也通過與重構(gòu)了Mn-原卟啉IX的氧化還原失活細(xì)胞色素b₅的產(chǎn)物形成速率比較得到證實[38]。以17-OH PREG為底物，DHEA的產(chǎn)生速率在天然細(xì)胞色素b₅存在下加速了5倍，而在Mn替代的b5存在下未觀察到加速。這些觀察結(jié)果解釋了在b5存在下CYP17A1改善的偶聯(lián)和活化，并表明細(xì)胞色素b₅在其他P450酶中扮演著相同的角色。

我們的結(jié)果可以與最近報道的從CPR和細(xì)胞色素b₅到飽和底物的CYP17A1的第一次和第二次電子傳遞速率的動力學(xué)研究進(jìn)行比較[70]。這些實驗在約100 μM DLPC并添加了去污劑Anapoe-X-305的混合物中進(jìn)行；未發(fā)現(xiàn)從b5和從CPR的第二次電子傳遞速率有顯著差異。主要結(jié)論，即還原型Cytb₅能夠傳遞第二個電子并在裂解反應(yīng)中形成產(chǎn)物，在兩項研究中是相同的。

共振拉曼（rR）光譜為了解CYP17A1中雙氧部分與活性位點結(jié)合底物的氫鍵以及 predisposed for catalysis 的底物定位提供了前所未有的見解。使用rR光譜結(jié)合CYP17A1氧合復(fù)合物的低溫輻照還原，獲得了關(guān)于催化活性中間體的詳細(xì)信息，如本綜述下文所述。