《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：METTL3-dependent N6-methyladenosine modification on LGMN mRNA promotes macrophage ferroptosis and atherosclerosis
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動脈粥樣硬化中METTL3依賴的m6A修飾通過上調legumain（LGMN）促進巨噬細胞鐵死亡，加劇斑塊形成，抑制兩者可減輕AS。YTHDF1介導m6A-LGMN mRNA翻譯調控。
楊賀|姜凱生|孫俊宏|趙倩豪|岳家成|魏文釗|曹杰|鄭大|姚輝|趙書全|趙虎|黃二文
中國廣東省中山醫學院轉化法醫學工程技術研究中心法醫學系，廣州，廣東
摘要
N6-甲基腺苷（m6A）修飾在多種生物過程中發揮著重要作用，但其在大噬菌體中的作用以及其與鐵死亡（ferroptosis）在促進動脈粥樣硬化（AS）中的潛在聯系仍不清楚。本研究觀察到，患有動脈粥樣硬化的小鼠動脈中m6A修飾水平和甲基轉移酶樣3（METTL3）的表達均升高。無論是小鼠還是人類的動脈粥樣硬化動脈中，METTL3陽性巨噬細胞的數量都增加了。系統性地抑制METTL3或特異性敲低巨噬細胞中的METTL3可以減輕動脈粥樣硬化斑塊的形成。RNA測序顯示，在骨髓來源的巨噬細胞（BMDM）中，鐵死亡相關基因的表達增強。與此一致的是，抑制鐵死亡也減少了動脈粥樣硬化斑塊的形成。進一步分析表明，小鼠動脈粥樣硬化動脈中的m6A修飾和legumain（LGMN）表達增加。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）處理的BMDM以及動脈粥樣硬化病變中的巨噬細胞中也檢測到了LGMN表達的升高。在BMDM中敲低LGMN可以減輕ox-LDL誘導的鐵死亡、脂質沉積和炎癥反應。在小鼠中特異性敲低巨噬細胞中的LGMN可以減少動脈粥樣硬化斑塊的形成和鐵死亡。此外，特異性敲低巨噬細胞中的METTL3可以抑制動脈粥樣硬化動脈中LGMN表達的上調。METTL3敲低消除了ox-LDL對BMDM的影響，但LGMN過表達可以恢復這種影響。機制上，YTHDF1與m6A甲基化的LGMN mRNA結合并增強其翻譯。綜上所述，體內和體外實驗結果表明LGMN通過將METTL3依賴的m6A修飾與巨噬細胞鐵死亡聯系起來，成為動脈粥樣硬化的一種新的介導因子。
引言
動脈粥樣硬化（AS）是一種慢性炎癥性疾病，其特征是脂質沉積[1]、炎癥細胞浸潤[2]、動脈鈣化以及動脈壁內其他成分的積累[3]，從而導致動脈粥樣硬化斑塊逐漸形成。隨著斑塊的發展，動脈管腔變窄，阻礙正常血流[4]。這種狹窄會增加循環壓力，常常導致高血壓[5]、心肌梗死[6]和中風[7]等嚴重疾病。盡管對人類健康構成重大威脅，但其潛在的發病機制仍不完全清楚。因此，深入研究其分子機制至關重要。
慢性炎癥反應是動脈粥樣硬化進展的關鍵驅動因素，斑塊的穩定性直接受到促炎因子和抗炎因子動態平衡的調節[8]。巨噬細胞作為炎癥的核心調節器，可以分化為兩種不同的表型：促炎型M1型和抗炎型M2型[9]。從M1型向M2型的轉變有助于減少炎癥并抑制動脈粥樣硬化的進展[10]。值得注意的是，在晚期動脈粥樣硬化中，持續的M1型極化和脂質負荷巨噬細胞的吞噬作用受損會導致細胞凋亡后壞死，加劇炎癥并促進斑塊不穩定和破裂[11]。因此，抑制巨噬細胞死亡可能是減輕炎癥和緩解動脈粥樣硬化的有效策略[12]。雖然M1型巨噬細胞在胰腺β細胞凋亡中的關鍵作用已經得到證實[13]，但它們在動脈粥樣硬化機制中的參與仍需進一步探索。
N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中最豐富的RNA修飾類型，由m6A甲基轉移酶（寫入器）和去甲基酶（擦除器）調控[14]。METTL3是一種關鍵的m6A甲基轉移酶，它將甲基從S-腺苷甲硫氨酸轉移到mRNA上的腺苷殘基上，從而催化m6A修飾[15]。主要的m6A讀取器包括YTH結構域家族成員1（YTHDF1）、YTHDF2和YTHDF3，它們通過影響mRNA的翻譯、穩定性和降解來調節m6A修飾的RNA的功能[16,17]。具體來說，YTHDF1增強mRNA翻譯，YTHDF2調節mRNA穩定性，而YTHDF3同時調節翻譯和降解[17,18]。METTL3的突變或異常表達與多種病理狀況相關，包括心臟肥大[19]、心臟纖維化[20]和癌癥[21]。最近的研究表明，血管內皮細胞中的METTL3和METTL14通過介導促炎效應來調節動脈粥樣硬化的進展，揭示了RNA m6A修飾與動脈粥樣硬化之間的聯系[22]。然而，m6A修飾在動脈粥樣硬化中的更廣泛作用，例如其在調節巨噬細胞活性中的作用，仍有待研究。
鐵死亡是一種由鐵依賴的脂質過氧化引起的細胞死亡類型，已被發現是動脈粥樣硬化的中介因素[23,24]。Legumain（LGMN）是一種參與溶酶體蛋白處理的保守天冬酰胺內肽酶，在免疫反應中起重要作用[25]。研究表明，LGMN參與免疫細胞介導的鐵死亡[26]，并通過谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）促進腎小管鐵死亡，導致急性腎損傷[27]。研究發現，動脈粥樣硬化患者的血漿和斑塊中LGMN水平升高，尤其是M1型巨噬細胞的分泌顯著增加[28]。LGMN參與巨噬細胞衍生的泡沫細胞形成[29]、細胞外基質相關的血管重塑[30]，以及可能參與動脈粥樣硬化斑塊的穩定性[31]。然而，直接證明LGMN在動脈粥樣硬化發展中的作用的證據仍然缺乏。
本研究旨在探討mRNA m6A修飾與鐵死亡在調節動脈粥樣硬化進展之間的潛在聯系。我們發現METTL3通過m6A修飾上調巨噬細胞中的LGMN表達，從而促進巨噬細胞鐵死亡并加重動脈粥樣硬化。這些結果將m6A修飾和鐵死亡聯系起來，確定了LGMN作為動脈粥樣硬化的新型介導因子，并擴展了對動脈粥樣硬化發病機制的理解。
實驗動物
我們從GemPharmatech有限公司獲得了C57BL/6背景下的雄性載脂蛋白E敲除（ApoE?/?）小鼠和雄性野生型（WT）C57BL/6J小鼠（20±2克，6周齡）。這些小鼠在無特定病原體的條件下飼養（溫度：22±2°C，濕度：50±10%，12小時光照/12小時黑暗周期）。所有動物實驗均獲得了中國中山大學動物護理和使用委員會的批準（編號：SYSU-IACUC-2023-001776）。
動物分組和處理
METTL3在喂食高脂肪飲食（HFD）的ApoE?/?小鼠中高表達
MeRIP測序顯示，喂食HFD的ApoE?/?小鼠主動脈組織中的m6A修飾顯著增加，其中54.7%的m6A峰位于CDS區域（圖1A和B）。與WT組相比，ApoE?/?小鼠主動脈組織中的整體m6A水平顯著升高（圖1C和D）。為了研究在動脈粥樣硬化發展過程中調節m6A甲基化的具體分子，我們系統地評估了關鍵m6A相關酶的表達...
討論
動脈粥樣硬化是多種心血管疾病的主要病理基礎，是全球導致殘疾和早死的主要原因[35]。越來越多的證據表明，包括由m6A“寫入器”蛋白METTL3催化的轉錄后RNA修飾在調節動脈粥樣硬化進展中起著關鍵作用[36]。METTL3具有m6A修飾的催化活性，已被廣泛研究并確定為多種疾病的關鍵調節因子[37]。
結論
我們的研究發現，METTL3通過m6A修飾上調巨噬細胞中的LGMN表達，從而增強巨噬細胞鐵死亡并加速動脈粥樣硬化的進展。本研究確定了LGMN作為METTL3調控巨噬細胞鐵死亡的新下游靶點，并確立了其作為動脈粥樣硬化介導因子的作用。
CRediT作者貢獻聲明
楊賀：撰寫初稿、進行研究、進行正式分析、數據管理。
姜凱生：撰寫初稿、進行研究、進行正式分析、數據管理、概念構思。
孫俊宏：方法學設計、進行研究、進行正式分析、概念構思。
趙倩豪：方法學設計、進行正式分析、概念構思。
岳家成：方法學設計、進行正式分析。
魏文釗：進行正式分析、概念構思。
曹杰：驗證、方法學設計。
鄭大：進行研究。
寫作過程中使用生成式AI和AI輔助技術的聲明
作者在撰寫本手稿過程中沒有使用生成式AI或AI輔助技術。
資助聲明
本研究得到了中國國家重點研發計劃（項目編號：2023YFA1800901和2023YFC3303902）的支持。
