新生兒壞死性小腸結腸炎（NEC）是一種主要影響早產兒的毀滅性胃腸道急癥，在極低出生體重兒中發病率達5%-10%，死亡率高達20%-30%。盡管新生兒護理水平不斷提升，NEC仍是全球新生兒重癥監護室發病和死亡的主要原因。該疾病以腸道炎癥、屏障破壞和最終腸壁壞死為特征。NEC的發病機制涉及早產、腸道菌群失調、缺血再灌注損傷以及未成熟腸道內宿主免疫反應失調等多因素相互作用。這些損傷導致炎癥級聯反應的過度激活和氧化應激的產生，它們是腸道上皮細胞損傷和組織壞死進展的核心驅動因素。

炎癥是NEC病理生理學的一個標志。促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和干擾素-γ（IFN-γ），在NEC中顯著升高，它們在放大炎癥反應和破壞腸道屏障方面起著關鍵作用。同時，氧化應激——由活性氧（ROS）的產生與抗氧化防御系統能力之間的失衡引起——是NEC發生的關鍵因素。早產兒的未成熟腸道由于抗氧化機制不完善，特別容易受到氧化損傷。氧化應激直接損害細胞組分，并與其他形式的調節性細胞死亡（RCD）密切相關。

在RCD通路中，鐵死亡已成為多種胃腸道病理中的重要機制，包括炎癥性腸病和缺血再灌注損傷。鐵死亡是一種鐵依賴性的RCD，由脂質過氧化物的積累驅動，這種積累源于細胞抗氧化防御系統的破壞和鐵代謝的改變。蛋白質如長鏈脂酰輔酶A合成酶4（ACSL4）通過促進多不飽和脂肪酸摻入膜磷脂來促進鐵死亡，而鐵蛋白重鏈1（FTH1）通過螯合鐵起到保護作用。總體而言，炎癥和氧化應激的匯聚為IECs中的鐵死亡創造了有利環境，這可能代表了NEC發病機制中一個關鍵但尚未被充分探索的軸心。

5′-氨基乙酰丙酸合酶2（ALAS2）是紅系細胞中血紅素合成通路的限速酶，對鐵利用和血紅蛋白產生至關重要。ALAS2活性影響細胞鐵代謝和氧化還原穩態，這些過程與鐵死亡易感性內在相關。然而，ALAS2在腸道炎癥，特別是在NEC及其相關細胞死亡通路（如鐵死亡）中的具體作用尚未被研究。通過分析GEO數據庫（GSE64801、GSE193177和GSE198372）的原始數據，發現急性早產NEC患者和NEC模型新生小鼠的回腸組織中ALAS2表達顯著下調。基于上述研究，有理由假設ALAS2可能參與NEC的進展，并且很可能與鐵死亡相關。

本研究旨在體內外建立NEC模型，研究ALAS2對NEC的影響。研究發現ALAS2通過抑制IECs中的氧化應激和鐵死亡來改善NEC。本研究結果可能為NEC治療的理論基礎提供有用信息。

新生小鼠NEC模型的建立參照先前描述的方法并稍作調整。購買10周齡雌雄C57BL/6小鼠，自由交配受孕。在出生后第10天（P10），將新生小鼠隨機分為兩組：對照組和新生NEC組。對照組小鼠母乳喂養，不做任何干預。NEC組小鼠與母鼠分離，在28°C恒溫箱中飼養。在出生后第10至14天（P10-14），通過口服灌胃每4小時給予配方奶30 μL/g體重，并每天兩次對新生小鼠進行缺氧刺激（5%氧氣和95%氮氣）2分鐘和冷刺激（4°C）10分鐘。每天記錄體重和生存狀況。實驗結束后，收集腸道組織用于后續實驗。所有動物實驗程序均經哈爾濱醫科大學附屬第六醫院倫理委員會批準（批準號LC2024-078）。

大鼠腸道上皮細胞IEC-6購自iCell Bioscience Technology Co., Ltd.。IEC-6細胞使用含10%胎牛血清、1%抗生素（20 μg/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）和0.01 mg/mL胰島素的DMEM培養基培養。細胞在37°C、5% CO₂的培養箱中維持。

將ALAS2編碼序列插入慢病毒表達載體pLVX-IRES-puro的XhoI/NotI位點，然后與包膜質粒和包裝質粒混合。使用Lipo 3000轉染HEK293T細胞以產生慢病毒。IEC-6細胞接種于6孔板，當融合度達50%時，以50的感染復數（MOI）感染慢病毒，并在37°C、5% CO₂培養箱中繼續培養。

采用蘇木精-伊紅（H&E）染色觀察腸道組織病理學變化。通過免疫熒光檢測ALAS2在腸道組織中的表達和定位。使用逆轉錄定量PCR（RT-qPCR）和蛋白質印跡（Western Blot）分別檢測ALAS2、ACSL4和FTH1的mRNA和蛋白表達水平。通過相應試劑盒檢測組織中Fe²⁺、丙二醛（MDA）含量以及超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、過氧化氫酶（CAT）的活性。使用流式細胞術檢測細胞壞死，CCK-8法檢測細胞活力。采用C11 BODIPY 581/591熒光探針檢測脂質ROS水平，JC-1染色檢測線粒體膜電位變化。透射電子顯微鏡觀察線粒體形態。

收集對照組和ALAS2過表達的細胞，進行非靶向代謝組學分析。采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）評估樣本分布。以變量投影重要度（VIP）>1和p < 0.05為標準篩選差異代謝物，并進行京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。

所有實驗數據以均值±標準差表示。使用GraphPad Prism 9.5軟件進行數據分析。兩組間差異顯著性采用非配對t檢驗評估，多組比較采用單因素方差分析（ANOVA）及Tukey事后檢驗。p < 0.05認為具有統計學意義。

為了尋找新生兒NEC的有效生物標志物，從GEO數據庫獲取了正常和新生兒NEC組織的原始數據，并篩選了三個數據集（GSE64801、GSE193177和GSE198372）。進一步分析了三個NEC相關數據集中腸道組織的差異表達基因（DEGs），篩選標準為|log₂FC| > 1.5且調整后p < 0.05。熱圖顯示了這些DEGs的分布。韋恩圖分析表明，ALAS2是三個數據集共有的唯一下調基因。ALAS2在多種疾病中發揮作用，但其與NEC的關聯尚未見報道。因此，選擇ALAS2進行深入研究。

成功建立了新生小鼠NEC模型。與對照組相比，NEC組小鼠體重顯著下降，死亡率為20%。NEC組小鼠出現明顯的腸道腫脹、腸氣沉積和腸壁變薄。腸道組織外觀評估顯示NEC組腸腔擴張、腸壁顏色改變，而對照組未見明顯腸道損傷。H&E染色顯示，對照組腸道組織結構完整、排列有序，而NEC組腸道組織排列不規則、肌層變薄、壞死嚴重。NEC組腸道組織中TNF-α和IFN-γ含量也顯著高于對照組。這些結果表明新生小鼠NEC模型建立成功。

評估了NEC模型中ALAS2的表達。與對照組相比，NEC組腸道組織中ALAS2 mRNA和蛋白相對表達量顯著降低。免疫熒光檢測也顯示出類似結果。進一步檢測了NEC組小鼠腸道組織中氧化應激和鐵死亡水平的變化。與對照組相比，NEC組小鼠回腸組織中Fe²⁺和MDA水平升高，而SOD水平降低。透射電子顯微鏡下觀察到NEC組線粒體出現明顯的形態學變化，包括線粒體皺縮變小、基質密度增加、嵴減少。蛋白質印跡檢測發現NEC組小鼠腸道組織中ACSL4表達升高，而FTH1表達受到抑制。綜上所述，在NEC模型中，ALAS2表達下調，而氧化應激和鐵死亡水平上調。

通過用TNF-α和IFN-γ誘導IEC-6細胞，進一步探討了ALAS2在體外的表達和功能。流式細胞術檢測不同時間點的細胞死亡情況，發現隨著處理時間的延長，細胞壞死顯著增加。此外，在細胞損傷過程中，ALAS2表達逐漸下調。這些數據表明，在TNF-α和IFN-γ誘導的IECs中ALAS2表達降低。

上述發現提示ALAS2可能在NEC進展中起重要作用。為驗證這一假設，構建了ALAS2過表達的IEC-6細胞。轉染ALAS2過表達慢病毒后，細胞中ALAS2表達顯著增加。隨后全面評估了ALAS2過表達對IEC-6細胞功能的影響。TNF-α和IFN-γ處理導致細胞死亡率增加、細胞活力抑制，但ALAS2過表達部分逆轉了這些現象。此外，TNF-α和IFN-γ誘導細胞內Fe²⁺水平升高，提示細胞發生了鐵死亡。通過BODIPY C11探針檢測脂質ROS水平，發現TNF-α和IFN-γ暴露后細胞內脂質ROS水平升高。JC-1染色進一步觀察到TNF-α和IFN-γ處理的細胞線粒體膜電位降低。然而，ALAS2過表達減弱了所有這些反應。隨后通過試劑盒檢測細胞中MDA含量，發現ALAS2過表達抑制了由TNF-α和IFN-γ處理引起的MDA水平升高。此外，暴露于TNF-α和IFN-γ后，抗氧化應激相關標志物（GSH、CAT和SOD）水平下調，但ALAS2過表達顯著恢復了這些因子的表達。最后，通過蛋白質印跡檢測各組細胞中ACSL4和FTH1的表達。與ACSL4不同，TNF-α和IFN-γ誘導的細胞中FTH1蛋白表達降低，但ALAS2過表達部分恢復了FTH1的表達。這些結果表明，ALAS2抑制了IEC-6細胞中的氧化應激和鐵死亡水平。

為了進一步研究ALAS2在NEC進展中的作用機制，收集了對照組和ALAS2過表達的細胞，利用非靶向代謝組學探索ALAS2可能影響的代謝物。首先應用主成分分析（PCA）檢查樣本數據的整體分布，得分圖顯示樣本分散在不同區域。此外，有監督的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）進一步證明了對照組細胞和ALAS2過表達細胞之間具有良好的分離模式。然后以VIP > 1和p < 0.05為篩選標準篩選差異代謝物，熱圖揭示了對照組和ALAS2過表達組代謝物的明顯不同模式。基于改變的代謝物進行的KEGG通路富集分析顯示，約20條生物通路發生顯著變化，主要涉及蛋白質消化吸收、嘧啶代謝、維生素消化吸收、癌癥中的中央碳代謝、植物次級代謝產物的生物合成以及代謝通路。

盡管經過數十年研究，NEC的發病機制仍未完全明了。現有證據表明炎癥、細菌感染、缺氧等多種因素之間存在復雜的相互作用，其中氧化應激是損傷的關鍵放大器。目前，NEC的可用治療方案缺乏特異性靶點，主要集中于改善腸道環境。由于預防和治療的局限性，NEC的死亡率長期未見顯著改善。本研究首次發現ALAS2下調是NEC發病機制中一個未被認識的貢獻者，從機制上將受損的血紅素合成與氧化應激和鐵死亡聯系起來，這一發現具有重要的治療意義。

炎癥在NEC中的核心作用已得到充分證實。升高的TNF-α和IFN-γ通過調節緊密連接使上皮屏障破壞持續惡化，導致腸道屏障功能進一步惡化。與之前的報道一致，我們的NEC小鼠模型中TNF-α和IFN-γ等炎癥因子水平顯著升高。炎癥介質與氧化應激協同作用，這對抗氧化防御系統不成熟的早產兒尤為有害。這些過程進一步導致蛋白質和細胞膜過氧化，以及過量MDA產生，造成細胞損傷。我們的數據證實了這種相互作用：NEC組織表現出典型的氧化損傷標志物（Fe²⁺/MDA升高，SOD降低）。關鍵的是，我們通過證明ALAS2恢復可正常化抗氧化能力（增加GSH/CAT/SOD），擴展了先前關于氧化還原失衡的觀察，提示其在經典血紅素合成功能之外還具有調節作用。

近年來，IECs過度死亡導致腸道屏障功能障礙的機制一直是NEC pathogenesis研究的熱點。IECs是位于腸腔的連續單層細胞結構，細胞間緊密連接加固了腸道的物理屏障，是抵御環境和微生物攻擊的第一道防線。鐵死亡作為一種鐵依賴性的RCD，已成為NEC中IEC死亡的關鍵介質。與凋亡或焦亡不同，鐵死亡由脂質過氧化和線粒體功能障礙驅動，這些過程與氧化應激緊密相關。我們的發現與先前在NEC模型中觀察到的游離鐵和線粒體功能障礙的報告一致。在我們的NEC模型中，IECs表現出鐵亡