本研究旨在探討重組血栓調(diào)節(jié)蛋白第一結(jié)構(gòu)域（rTMD1）在糖尿病角膜傷口愈合中的治療潛力及其作用機(jī)制。研究采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備并純化rTMD1蛋白，通過體外高糖（HG）環(huán)境下培養(yǎng)的人角膜上皮細(xì)胞（HCECs）劃痕實(shí)驗(yàn)，以及鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的C57BL/6糖尿病小鼠角膜傷口模型，評(píng)估rTMD1對(duì)傷口愈合的促進(jìn)作用。利用定量PCR（qPCR）、蛋白質(zhì)印跡（Western blot）和免疫熒光染色等技術(shù)分析炎癥標(biāo)志物的表達(dá)。

研究結(jié)果顯示，在體外實(shí)驗(yàn)中，rTMD1處理顯著提高了高糖環(huán)境下HCECs的傷口愈合率（p= 0.0049）。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，rTMD1治療顯著加速了糖尿病小鼠角膜傷口閉合，在24小時(shí)（p= 0.005）和48小時(shí)（p< 0.0001）時(shí)效果均優(yōu)于PBS對(duì)照組。分子機(jī)制研究表明，rTMD1能夠下調(diào)HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，抑制NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。免疫熒光分析進(jìn)一步證實(shí)，rTMD1治療減少了糖尿病角膜中F4/80⁺巨噬細(xì)胞和NIMP-R14⁺中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。

結(jié)論：局部應(yīng)用rTMD1通過抑制HMGB1/TLR4/NLRP3信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，有效促進(jìn)糖尿病條件下的角膜上皮傷口愈合。rTMD1有望成為治療糖尿病角膜病變的潛在治療藥物，但其臨床療效和安全性尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

糖尿病（DM）是一種常見的慢性代謝性疾病，其特征是長(zhǎng)期高血糖和多種并發(fā)癥，2021年全球患者約5.29億。糖尿病角膜病變（DK）是糖尿病最常見的眼部并發(fā)癥之一，在糖尿病患者中的患病率為47%–64%。DK臨床表現(xiàn)為持續(xù)性角膜糜爛和潰瘍，常伴有角膜敏感性降低，主要源于角膜傷口愈合受損和神經(jīng)再生延遲。若處理不當(dāng)，DK可進(jìn)展為角膜穿孔和不可逆的視力喪失。當(dāng)前的治療策略側(cè)重于控制血糖水平以及通過局部抗生素和潤(rùn)滑劑進(jìn)行對(duì)癥治療，但這些方法療效有限，因?yàn)樗鼈兾茨芙鉀Q糖尿病相關(guān)的角膜傷口愈合延遲的根本問題。

近年研究表明，過度炎癥和感覺神經(jīng)病變是導(dǎo)致DK的關(guān)鍵因素。適當(dāng)?shù)慕悄�傷口愈合需要炎癥與再生之間的精細(xì)平衡。然而，在DK中，高血糖誘導(dǎo)的晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）和活性氧（ROS）積累通過損害細(xì)胞增殖、加劇炎癥和增加細(xì)胞死亡來破壞這種平衡，最終導(dǎo)致傷口愈合延遲。此外，最新研究發(fā)現(xiàn)AGEs和ROS可激活NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎癥小體通路，導(dǎo)致白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（IL-18）產(chǎn)生增加，此級(jí)聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)細(xì)胞焦亡，進(jìn)一步加重角膜傷口愈合障礙。

血栓調(diào)節(jié)蛋白（TM）是一種多功能跨膜糖蛋白，由五個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域組成：一個(gè)凝集素樣結(jié)構(gòu)域（D1）、一個(gè)包含六個(gè)表皮生長(zhǎng)因子（EGF）樣結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域（D2）、一個(gè)富含絲氨酸和蘇氨酸的結(jié)構(gòu)域（D3）、一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（D4）和一個(gè)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域（D5）。TM最初被鑒定為血管內(nèi)皮細(xì)胞中具有抗凝血特性的凝血酶輔因子，現(xiàn)在日益認(rèn)識(shí)到其抗炎功能，特別是其凝集素樣結(jié)構(gòu)域（TMD1）的作用。研究表明，TM可以隔離高遷移率族蛋白B1（HMGB1，一種損傷相關(guān)分子模式分子DAMP），從而減輕炎癥反應(yīng)。此外，研究證明TMD1可通過抑制核因子κB（NF-κB）/NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥和細(xì)胞凋亡來緩解小鼠糖尿病腎病。在角膜中，我們前期的研究表明，TM在傷口愈合早期表達(dá)增加，并在傷口閉合后逐漸下降。此外，我們發(fā)現(xiàn)重組TM EGF樣結(jié)構(gòu)域加絲氨酸/蘇氨酸豐富結(jié)構(gòu)域（rTMD23）可有效促進(jìn)角膜上皮傷口愈合。

鑒于其抗炎特性和促進(jìn)皮膚傷口愈合的能力，TM，特別是其凝集素樣結(jié)構(gòu)域（TMD1），有潛力成為DK的治療藥物。然而，TMD1對(duì)糖尿病角膜傷口愈合的影響及其潛在機(jī)制尚不清楚。因此，本研究旨在利用原代人角膜上皮細(xì)胞（HCECs）和動(dòng)物模型探討重組TMD1（rTMD1）在糖尿病角膜傷口愈合中的治療潛力。

rTMD1蛋白使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備，隨后通過鎳螯合瓊脂糖柱進(jìn)行純化。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）評(píng)估所得rTMD1蛋白的純度。

本研究使用7-9周齡雄性C57BL/6小鼠。通過連續(xù)五天腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，50 mg/kg）誘導(dǎo)1型糖尿病。最后一次STZ注射后2周，使用血糖儀測(cè)量血清葡萄糖水平。血清葡萄糖水平超過250 mg/dL的小鼠被歸類為糖尿病小鼠。

在手術(shù)前，正常和糖尿病小鼠通過腹腔注射 Zoletil（50 mg/kg）聯(lián)合 Xylazine（2.5 mg/kg）進(jìn)行麻醉。此外，角膜局部滴注0.5%丙美卡因鹽酸鹽進(jìn)行麻醉。使用2毫米活檢穿孔器劃定一眼中央角膜區(qū)域，然后使用Algerbrush II角膜銹環(huán)去除器輕柔去除中央角膜上皮，創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)化傷口。在清創(chuàng)術(shù)后立即（0時(shí)）和術(shù)后24小時(shí)兩次進(jìn)行局部治療。糖尿病治療組（DM-rTMD1）每次滴加5 μL濃度為2 mg/mL的rTMD1 PBS溶液（10 μg/次；總劑量20 μg/眼）。對(duì)照組（正常-PBS和DM-PBS）在相同時(shí)間點(diǎn)滴加5 μL PBS。使用熒光素染色監(jiān)測(cè)角膜傷口愈合，并在0、24和48小時(shí)使用裂隙燈顯微鏡拍攝殘留上皮缺損照片。使用ImageJ軟件量化傷口愈合面積以確定傷口閉合百分比。48小時(shí)后，按照AVMA指南，以30%腔體體積/分鐘的流速通過漸進(jìn)填充二氧化碳（CO₂）吸入法處死小鼠。隨后收集角膜標(biāo)本進(jìn)行免疫熒光染色。

從公司購(gòu)買原代人角膜上皮細(xì)胞（HCECs），并在添加了EGF、氫化可的松和胎牛血清（FBS）的人上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為建立正常和高糖（HG）條件，將細(xì)胞接種到六孔板中，并在含有5 mM葡萄糖（正常葡萄糖，NG）或30 mM葡萄糖（HG）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)48小時(shí)。細(xì)胞匯合后，使用200 μL移液器吸頭創(chuàng)建劃痕。然后將細(xì)胞在NG培養(yǎng)基、HG培養(yǎng)基或補(bǔ)充了20 nM TMD1的HG培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)。在劃痕后0和24小時(shí)拍攝圖像，并使用ImageJ軟件分析傷口閉合百分比。

使用Real Genomics總RNA提取試劑盒從HCECs中提取總RNA。使用PowerUp SYBR Green Master Mix進(jìn)行qPCR。本研究中使用的引物列于表1。

使用放射免疫沉淀測(cè)定（RIPA）緩沖液從HCECs中提取總蛋白。大約20 μg總蛋白在10% SDS-PAGE凝膠上分離，隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。膜在室溫下用1%牛血清白蛋白（BSA）封閉1小時(shí)，然后在4°C下與針對(duì)HMGB1、TLR4、NLRP3、IL-1β和GAPDH的一抗孵育過夜。孵育后，在室溫下應(yīng)用物種特異性二抗1小時(shí)。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑顯示蛋白信號(hào)，并使用Amersham Imager 600捕獲。使用ImageJ軟件量化條帶強(qiáng)度。

收集角膜樣本，固定并石蠟包埋，然后切片厚度為5 μm。經(jīng)過脫蠟、水化和抗原修復(fù)后，切片用0.1% Triton X-100透化，并在室溫下用5%山羊血清封閉1小時(shí)。然后將切片在4°C下與針對(duì)HMGB1、TLR4、NLRP3、IL-1β、F4/80和NIMP-R14的一抗孵育過夜。洗滌后，切片在室溫下與Alexa Fluor 488或546標(biāo)記的抗兔IgG孵育1小時(shí)，細(xì)胞核用DAPI復(fù)染。通過省略一抗并在相同成像設(shè)置下僅與二抗孵育來處理陰性對(duì)照。

對(duì)于定量分析，在所有組相同的顯微鏡設(shè)置下捕獲免疫熒光圖像。每個(gè)切片隨機(jī)選擇三個(gè)不重疊的高倍視野（HPF）。聯(lián)合評(píng)估上皮和基質(zhì)區(qū)域進(jìn)行量化。對(duì)于HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β，使用ImageJ通過勾畫感興趣區(qū)域并減去陰性對(duì)照切片的背景信號(hào)來測(cè)量每個(gè)HPF的平均熒光強(qiáng)度（MFI）。對(duì)于F4/80和NIMP-R14，手動(dòng)計(jì)數(shù)每個(gè)HPF的陽(yáng)性染色細(xì)胞。對(duì)所有組的值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較以評(píng)估相對(duì)表達(dá)水平。

所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。兩組比較使用非配對(duì)雙尾Student t檢驗(yàn)，三組及以上比較使用單因素方差分析（ANOVA），統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性設(shè)定為p< 0.05。所有統(tǒng)計(jì)分析均使用Prism 8.0軟件進(jìn)行。

為確定rTMD1是否在高糖條件下促進(jìn)角膜傷口愈合，我們建立了使用原代HCECs的劃痕損傷模型。細(xì)胞在用移液器吸頭誘導(dǎo)損傷后，在NG培養(yǎng)基、HG培養(yǎng)基或補(bǔ)充了rTMD1（20 nM）的HG培養(yǎng)基中培養(yǎng)。損傷后24小時(shí)，NG組、HG組和HG + rTMD1組的平均傷口愈合百分比分別為60.25%、41.93%和63.23%。與NG組相比，HG組的傷口愈合率顯著降低（n= 5; p= 0.0281），而HG + rTMD1組與HG組相比顯示出顯著更高的傷口愈合率（n= 5; p= 0.0049）。這些發(fā)現(xiàn)表明高糖環(huán)境損害人角膜上皮傷口愈合，而rTMD1在高糖條件下增強(qiáng)愈合過程。

既往研究表明TMD1通過NLRP3通路減輕糖尿病腎病的炎癥。為探索rTMD1促進(jìn)糖尿病條件下角膜傷口愈合的潛在機(jī)制，我們?cè)趽p傷后24小時(shí)使用qPCR和蛋白質(zhì)印跡法分析了HCECs中的mRNA和總蛋白水平。與NG組相比，HG組中HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β的mRNA表達(dá)水平顯著更高（HMGB1: p= 0.038, n= 5; TLR4: p= 0.0043, n= 6; NLRP3: p= 0.0002, n= 5; IL-1β: p= 0.0041, n= 6），表明HG條件促進(jìn)炎癥。然而，與HG組相比，rTMD1處理顯著降低了HG + rTMD1組中這些炎癥標(biāo)志物的mRNA表達(dá)（HMGB1: p= 0.0363, n= 5; TLR4: p= 0.0372, n= 6; NLRP3: p= 0.0128, n= 5; IL-1β: p= 0.0126, n= 6）。

類似地，蛋白質(zhì)印跡分析顯示，與HG組相比，HG + rTMD1組中HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β的蛋白水平顯著降低（HMGB1: p= 0.0083, n= 3; TLR4: p= 0.0418, n= 4; NLRP3: p= 0.0401, n= 4; IL-1β: p= 0.0383, n= 3）。這些發(fā)現(xiàn)表明rTMD1通過抑制HMGB1產(chǎn)生和TLR4/NLRP3/IL-1β信號(hào)通路來減輕炎癥，這可能有助于改善糖尿病條件下的角膜傷口愈合。

為研究rTMD1在體內(nèi)糖尿病角膜傷口愈合中的治療潛力，我們首先通過腹腔注射STZ在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)1型糖尿病。本研究共使用30只小鼠，計(jì)劃每組10只。在20只接受STZ誘導(dǎo)糖尿病的小鼠中，有6只未達(dá)到高血糖閾值被排除，最終14只糖尿病小鼠用于分析。隨后在中央角膜創(chuàng)建2毫米直徑的傷口。正常對(duì)照小鼠接受5 μL PBS，而糖尿病小鼠接受5 μL PBS（DM-PBS組）或rTMD1（DM-D1組）。熒光素染色顯示，在損傷后24小時(shí)（n= 7; DM-PBS: 90.8 ± 5.3% vs. 正常-PBS: 81.0 ± 8.4%; p= 0.0235）和48小時(shí)（n= 7; DM-PBS: 80.4 ± 13.6% vs. 正常-PBS: 32.0 ± 20.6%; p= 0.0002），DM-PBS組的殘留角膜缺損面積顯著大于正常對(duì)照組。相比之下，DM-D1組在24小時(shí)（n= 7; 73.9 ± 12.0% vs. 90.8 ± 5.3%; p= 0.005）和48小時(shí)（n= 7; 28.5 ± 11.3% vs. 80.4 ± 13.6%; p< 0.0001）顯示的缺損面積顯著小于DM-PBS組。這些發(fā)現(xiàn)表明rTMD1促進(jìn)糖尿病小鼠的角膜上皮傷口愈合。

為在體內(nèi)進(jìn)一步闡明rTMD1的抗炎作用，我們使用針對(duì)F4/80和NIMP-R14的免疫熒光染色檢查了糖尿病小鼠角膜中的白細(xì)胞浸潤(rùn)。與正常-PBS組相比，DM-PBS組的角膜顯示出F4/80⁺巨噬細(xì)胞和NIMP-R14⁺中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明糖尿病條件下炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增強(qiáng)。值得注意的是，rTMD1治療顯著減少了DM-D1組中這兩種細(xì)胞類型的存在，表明rTMD1減弱了糖尿病角膜中的炎癥細(xì)胞募集。

此外，我們使用針對(duì)HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β的免疫熒光染色評(píng)估了正常-PBS、DM-PBS和DM-D1組角膜切片中關(guān)鍵炎癥介質(zhì)的表達(dá)。與正常對(duì)照組相比，DM-PBS組的糖尿病角膜對(duì)所有四種標(biāo)志物顯示出更高的免疫反應(yīng)性。相比之下，rTMD1治療的糖尿病角膜對(duì)HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β的熒光強(qiáng)度顯著降低。這些發(fā)現(xiàn)表明rTMD1通過抑制白細(xì)胞浸潤(rùn)和下調(diào)整HMGB1/TLR4/NLRP3/IL-1β介導(dǎo)的炎癥來促進(jìn)糖尿病角膜傷口愈合。

DK是糖尿病常見的眼部并發(fā)癥，影響角膜，導(dǎo)致傷口愈合延遲和神經(jīng)支配受損。盡管越來越多的證據(jù)表明高血糖誘導(dǎo)的過度炎癥和神經(jīng)病變是導(dǎo)致DK的關(guān)鍵因素，但其完整發(fā)病機(jī)制和有效治療選擇仍不清楚。在本研究中，我們證明rTMD1在體外和體內(nèi)糖尿病模型中抑制HMGB1/TLR4/NLRP3介導(dǎo)的炎癥并加速角膜傷口愈合。這些發(fā)現(xiàn)表明rTMD1有潛力成為DK的潛在治療選擇。

TMD1是TM的凝集素樣結(jié)構(gòu)域，已證明具有抗炎和抗血管生成特性，這在糖尿病腎病和氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變等疾病中有益。這些特性使TMD1特別適合治療DK。因此，在本研究中，我們建立了體外和體內(nèi)模型來研究rTMD1在糖尿病角膜傷口愈合中的治療潛力和機(jī)制。在我們的HCECs劃痕損傷模型中，HG環(huán)境顯著損害傷口愈合，而rTMD1治療有效提高了愈合率。類似地，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中，局部使用rTMD1治療的小鼠與PBS治療組相比表現(xiàn)出顯著更快的傷口閉合。重要的是，rTMD1治療后未觀察到角膜新生血管，進(jìn)一步支持其適用于角膜治療。這些結(jié)果共同表明rTMD1在糖尿病條件下有效增強(qiáng)角膜傷口愈合。

使用蛋白質(zhì)印跡和qPCR進(jìn)行的分子分析在我們的體外模型中顯示，與NG對(duì)照組相比，HG條件顯著上調(diào)了HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β的表達(dá)。rTMD1處理顯著降低了這些炎癥標(biāo)志物的表達(dá)。一致地，我們體內(nèi)模型中的免疫熒光染色證實(shí)rTMD1有效抑制了HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β的表達(dá)，突出了其在糖尿病角膜中的抗炎作用。除了抑制炎癥信號(hào)外，rTMD1還減少了糖尿病角膜中的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)。具體而言，免疫熒光分析顯示rTMD1顯著減少了F4/80⁺巨噬細(xì)胞和NIMP-R14⁺中性粒細(xì)胞的存在，進(jìn)一步支持其在高糖條件下減輕角膜炎癥的作用。

HMGB1是一種典型的DAMP，它與TLR4結(jié)合激活NF-κB并啟動(dòng)NLRP3炎癥小體，從而放大IL-1β驅(qū)動(dòng)的炎癥；糖尿病相關(guān)的AGEs和ROS進(jìn)一步增強(qiáng)NLRP3激活和細(xì)胞焦亡，延遲上皮修復(fù)。在我們的模型中，rTMD1降低了HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β，同時(shí)降低了角膜F4/80⁺巨噬細(xì)胞和NIMP-R14⁺中性粒細(xì)胞，表明廣泛抑制了炎癥環(huán)境。通過限制這種過度炎癥反應(yīng)，rTMD1可能促進(jìn)更有利于炎癥消退和組織修復(fù)的環(huán)境。從機(jī)制上講，TM的凝集素樣結(jié)構(gòu)域直接隔離細(xì)胞外HMGB1，限制其刺激模式識(shí)別受體的可用性，從而減弱下游信號(hào)傳導(dǎo)。同時(shí)，D1通過結(jié)合Lewis-Y決定簇中和脂多糖（LPS），從而削弱TLR4依賴性激活并減少粘附分子和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)。在糖尿病組織中，D1還增強(qiáng)NRF2相關(guān)的抗氧化防御，同時(shí)限制NF-κB/NLRP3信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡，這為我們?cè)诟咛菓?yīng)激下的發(fā)現(xiàn)提供了機(jī)制橋梁。盡管我們沒有測(cè)量切割的caspase-1、切割的或分泌的IL-1β，但先前的糖尿病模型顯示D1降低了caspase-1活性，降低了全身IL-1β和IL-18水平，并且在高糖條件下降低了細(xì)胞HMGB1。這些發(fā)現(xiàn)與我們觀察到的HMGB1、TLR4、NLRP3和IL-1β抑制一致，并支持rTMD1作為炎癥小體啟動(dòng)和激活的抑制劑。

除了細(xì)胞外隔離，我們的數(shù)據(jù)表明rTMD1也可能在轉(zhuǎn)錄水平抑制HMGB1的產(chǎn)生。在我們的模型中，rTMD1治療顯著降低了HMGB1 mRNA表達(dá)，表明在蛋白釋放上游存在調(diào)節(jié)效應(yīng)。一種可能的解釋是，角膜炎癥的減輕，如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少所示，導(dǎo)致HMGB1合成和主動(dòng)分泌減少。先前研究表明TMD1減弱NF-κB激活，這是控制炎癥條件下HMGB1表達(dá)和釋放的關(guān)鍵通路。這種反饋機(jī)制可能有助于rTMD1在糖尿病角膜損傷中更廣泛的抗炎和修復(fù)作用。

來自非糖尿病角膜損傷的證據(jù)進(jìn)一步支持rTMD1的多節(jié)點(diǎn)作用：在堿燒傷模型中，它促進(jìn)上皮恢復(fù)，將巨噬細(xì)胞極化從促炎M1（CD86）轉(zhuǎn)向修復(fù)性M2（CD206），并抑制ERK/HIF-1α及其下游的VEGF和TNF-α減少，這些變化有利于炎癥消退和組織修復(fù)。盡管尚未定義rTMD1的專用跨膜受體，但HMGB1隔離和LPS中和的結(jié)合，加上對(duì)ERK/HIF-1α–VEGF、NF-κB和NRF2通路的調(diào)節(jié)，為本文觀察到的炎癥信號(hào)廣泛減弱提供了一致的解釋。關(guān)于增殖效應(yīng)，我們的研究沒有直接量化上皮增殖；然而，我們前期的研究表明rTMD1在抑制致病性ERK/HIF-1α活性的同時(shí)保持細(xì)胞活力/增殖，這表明糖尿病中加速的閉合可能反映了炎癥障礙的解除和修復(fù)能力的維持，而不是非選擇性的有絲分裂刺激。總之，這些數(shù)據(jù)表明rTMD1賦予了一般的抗炎、促修復(fù)益處，并且在糖尿病角膜中，特異性糾正了對(duì)高血糖敏感的HMGB1/TLR4/NLRP3信號(hào)以促進(jìn)上皮再生。

本研究在轉(zhuǎn)化方面存在幾個(gè)局限性。首先，體外HCEC測(cè)定和STZ誘導(dǎo)的小鼠模型不能完全重現(xiàn)人類DK的慢性、多因素性質(zhì)。更大的轉(zhuǎn)化相關(guān)性需要在人類糖尿病角膜組織以及更接近人類眼部解剖結(jié)構(gòu)、愈合動(dòng)力學(xué)和神經(jīng)支配的更大糖尿病動(dòng)物模型中進(jìn)行評(píng)估。其次，盡管rTMD1在高糖條件下加速了上皮再生，但我們的終點(diǎn)主要捕獲了傷口閉合；需要分別量化上皮增殖和遷移以及評(píng)估角膜神經(jīng)支配和感覺功能的研究。第三，我們?cè)隗w外使用了單一濃度，在體內(nèi)使用了單一的局部給藥方案。劑量反應(yīng)關(guān)系、制劑優(yōu)化以及在角膜表面的停留時(shí)間仍有待確定。第四，我們沒有進(jìn)行專門的眼部生物安全性測(cè)試。先前的證據(jù)支持rTMD1的耐受性：在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變模型中，rTMD1未誘導(dǎo)細(xì)胞毒性并抑制了細(xì)胞凋亡，并且單獨(dú)的角膜研究已應(yīng)用2 mg/mL的局部rTMD1而未報(bào)告安全性信號(hào)。然而，局部rTMD1的正式臨床前計(jì)劃仍然是必需的，包括標(biāo)準(zhǔn)化的角膜毒性和刺激性測(cè)定。最后，機(jī)制分析集中于HMGB1/TLR4/NLRP3軸。其他通路可能也參與其中，包括ERK和HIF-1α調(diào)節(jié)、巨噬細(xì)胞極化和NRF2依賴性抗氧化反應(yīng)。明確的因果關(guān)系需要在糖尿病角膜系統(tǒng)中進(jìn)行靶向擾動(dòng)和通路水平驗(yàn)證。

總之，我們的研究表明局部應(yīng)用rTMD1通過抑制HMGB1/TLR4/NLRP3/IL-1β介導(dǎo)的炎癥來增強(qiáng)糖尿病角膜傷口愈合。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了rTMD1作為管理DK的有前景治療方法的潛力。需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)并探索rTMD1在臨床環(huán)境中的更廣泛治療意義。