《MEDIATORS OF INFLAMMATION》：Sirtuin 4 Knockout Aggravates Sepsis-Induced Acute Liver Injury by Enhancing Mitochondrial Fission and Mitophagy in Hepatocytes
編輯推薦：
本研究揭示了Sirtuin 4（Sirt4）在膿毒癥誘導的急性肝損傷（SALI）中的關鍵保護作用。通過盲腸結扎穿刺（CLP）小鼠模型和LPS處理的AML12細胞實驗，發現Sirt4敲除（KO）會通過增強線粒體分裂（DRP1/MFF↑）和線粒體自噬（PINK1/Parkin/LC3B↑）加重肝損傷，而Sirt4過表達（OE）則能通過抑制線粒體動力學失衡和過度線粒體自噬發揮保護作用。研究首次闡明Sirt4-DRP1-線粒體自噬軸是膿毒癥肝損傷的核心調控機制，為靶向Sirt4的治療策略提供了理論依據。
1. 引言
膿毒癥作為一種由感染引起的宿主反應失調導致的危及生命的器官功能障礙，是重癥監護病房患者死亡的主要原因之一。其病理過程始于病原體入侵引發的過度全身炎癥反應（即"細胞因子風暴"），進而進展為免疫抑制、代謝紊亂和持續性多器官功能障礙綜合征（MODS），死亡率居高不下。在MODS中，肝損傷占據核心地位。作為人體的代謝和免疫中心，肝臟在膿毒癥中極易受損，其功能障礙會進一步加劇整體病情的惡化，形成惡性循環。膿毒癥誘導的急性肝損傷（SALI）嚴重破壞代謝穩態的穩定性，削弱清除病原體的能力，預示著不良的臨床預后。因此，闡明膿毒癥肝損傷的分子機制對于制定新的治療策略至關重要。
線粒體作為細胞的能量工廠和凋亡、炎癥信號的整合中心，在膿毒癥的功能穩態中扮演雙重角色。適度的線粒體自噬（mitophagy）是清除受損線粒體、維持細胞健康的保護機制，然而過度或失控的線粒體自噬會導致細胞能量耗竭和死亡。線粒體動力學（融合與分裂）的平衡是維持其功能的基礎，過度分裂常與細胞損傷相關。Sirtuin 4（Sirt4）是一種位于線粒體的NAD+依賴性脫乙酰酶，近年來被發現其在能量代謝和應激反應中起關鍵作用。然而，Sirt4在膿毒癥這一重大應激模型中的作用，尤其是在關鍵器官肝臟中的功能研究甚少。其是否通過調控線粒體質量控制在膿毒癥肝損傷中發揮作用尚屬未知。基于Sirt4的線粒體定位及其在應激反應中的新興作用，本研究提出科學假設：Sirt4可能通過調控線粒體自噬和動力學平衡在膿毒癥肝損傷中發揮重要的保護作用。
2. 方法
本研究通過盲腸結扎穿刺（CLP）手術建立膿毒癥小鼠模型，比較野生型（WT）和Sirt4基因全身性敲除（Sirt4-KO）小鼠的肝損傷程度。采用血清天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和組織學分析評估肝損傷；通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清白細胞介素-6（IL-6）水平；采用蛋白質印跡（Western blotting）、免疫組織化學染色、免疫熒光染色、透射電子顯微鏡（TEM）觀察線粒體形態、線粒體膜電位（JC-1染色）、細胞凋亡（流式細胞術、TUNEL染色）等技術檢測線粒體自噬和線粒體動力學指標。體外實驗使用小鼠肝細胞系AML12，通過LPS刺激模擬膿毒癥誘導的肝損傷，并利用小干擾RNA（siRNA）敲低Sirt4或質粒過表達Sirt4進行功能驗證。使用DRP1抑制劑Mdivi-1處理細胞，探討其干預作用。
3. 結果
3.1. Sirt4在CLP處理的小鼠肝臟和LPS處理的AML12細胞中表達下調
免疫組化染色和蛋白質印跡結果顯示，與假手術（SHAM）組相比，CLP模型小鼠肝組織中Sirt4的表達顯著下調。體外實驗中，LPS刺激AML12細胞后，Sirt4蛋白水平也呈濃度依賴性下降。
3.2. Sirt4敲除加重CLP誘導的急性肝損傷
與WT小鼠相比，Sirt4-KO小鼠在CLP術后表現出更嚴重的肝功能障礙，血清AST、ALT和IL-6水平顯著升高。肝組織H&E染色顯示Sirt4-KO CLP小鼠有更嚴重的組織學評分，表現為壞死、血栓形成和炎性細胞浸潤。免疫組化顯示肝組織腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達增加，TUNEL染色顯示肝細胞凋亡加劇。
3.3. Sirt4敲除通過促進線粒體動力學失衡和線粒體自噬加劇肝細胞線粒體損傷
透射電鏡顯示Sirt4-KO小鼠肝細胞線粒體嵴減少、分裂增加。免疫組化和蛋白質印跡表明，與CLP組相比，Sirt4-KO CLP組小鼠肝組織中線粒體自噬標志物Parkin和LC3B的表達上調。同時，線粒體分裂相關蛋白DRP1和MFF表達增加，而融合相關蛋白MFN1表達下降。體外實驗在AML12細胞中敲低Sirt4并給予LPS刺激，得到了與體內實驗一致的結果。
3.4. Sirt4過表達減輕CLP誘導的急性肝損傷
通過尾靜脈注射攜帶Sirt4過表達載體的肝靶向AAV8病毒，在體過表達Sirt4。結果顯示，Sirt4-OE顯著改善了CLP引起的小鼠血清AST、ALT、IL-6升高，減輕了肝組織病理損傷、TNF-α表達和肝細胞凋亡。
3.5. Sirt4過表達通過抑制線粒體動力學失衡和線粒體自噬減輕肝細胞線粒體損傷
在Sirt4-OE的CLP小鼠肝臟中，線粒體嵴結構得到改善，Parkin表達降低。蛋白質印跡顯示Sirt4-OE抑制了線粒體自噬（Parkin, LC3B）和線粒體分裂（DRP1, MFF），并促進了線粒體融合（MFN1）。體外過表達Sirt4同樣逆轉了LPS引起的AML12細胞線粒體動力學失衡和過度線粒體自噬。
3.6. DRP1抑制劑Mdivi-1抑制Sirt4缺失引起的肝細胞損傷和線粒體損傷
在敲低Sirt4的AML12細胞中，使用DRP1抑制劑Mdivi-1處理。結果顯示，Mdivi-1減輕了LPS+siSirt4引起的細胞凋亡，改善了線粒體膜電位，并抑制了過度活化的線粒體自噬和線粒體分裂。
4. 討論
本研究主要發現包括：首先，在CLP誘導的膿毒癥模型中，小鼠肝臟Sirt4表達下調。其次，Sirt4基因敲除小鼠表現出比WT小鼠更嚴重的肝損傷和全身炎癥反應。Sirt4缺失通過破壞線粒體穩態，具體表現為過度激活的線粒體自噬和失衡的線粒體動力學（傾向于分裂），最終導致更嚴重的肝細胞損傷。機制上，Sirt4通過抑制膿毒癥誘導的肝細胞線粒體分裂來調節線粒體自噬。這一發現不僅確立了Sirt4在膿毒癥肝臟保護中的關鍵地位，更重要的是直接將Sirt4與線粒體質量控制的核心病理過程聯系起來，為膿毒癥肝損傷的臨床治療提供了有前景的新視角。
本研究與Sirt4作為細胞應激監護者的新興作用高度一致。Sirt4敲除小鼠在CLP術后表現出更高水平的血清AST/ALT、更嚴重的肝組織結構損傷和更高的促炎因子IL-6濃度，表明內源性Sirt4是對抗膿毒癥肝損傷的重要分子屏障。肝臟在膿毒癥的"免疫-代謝"交互對話中處于核心地位，Sirt4缺失可能同時破壞這兩方面的穩態。
本研究最關鍵的貢獻在于揭示了Sirt4與膿毒癥中線粒體質量控制之間的精確機制關聯。研究者提出Sirt4是線粒體自噬的"校準器"或"剎車"。在WT小鼠中，Sirt4的正常表達可能通過其ADP-核糖基轉移酶活性修飾線粒體自噬通路中的關鍵蛋白，從而將自噬流限制在適度、可控、有益的水平。Sirt4缺失導致線粒體動力學失衡，表現為線粒體碎片化加劇，這通常由過度增加的線粒體分裂蛋白DRP1和減少的融合因子MFN1引起。碎片化的線粒體不僅產能低下且更不穩定，更容易發生膜電位崩潰，成為線粒體自噬的靶標。值得注意的是，線粒體動力學與線粒體自噬之間存在密切對話：MFF介導的分裂是啟動線粒體自噬的前提，持續分裂促進廣泛的線粒體自噬。因此，在Sirt4-KO小鼠肝臟中觀察到的過度線粒體自噬和線粒體碎片化很可能是同一問題的兩個方面，形成正反饋循環，相互加劇，共同將肝細胞推向死亡。
Sirt4同時調控這兩個過程的機制尚未完全揭示。可能通過修飾DRP1抑制其GTP酶活性或線粒體募集，同時通過修飾OPA1促進融合來協調整個線粒體網絡的重塑。另一種可能是Sirt4通過調控共同的上游信號，如細胞能量狀態（AMPK/ATP）或氧化應激水平來整合代謝信號。未來研究的重點將是精確鑒定Sirt4在肝臟中的酶活性底物。
本研究結果具有深遠的轉化醫學意義。目前膿毒癥的治療仍主要側重于抗感染和支持治療，缺乏直接針對器官損傷的特異性藥物。該研究將Sirt4推向了舞臺中央，成為一個極具前景的新型治療靶點。理論上，通過小分子藥物激活Sirt4活性，可能校準膿毒癥中失控的線粒體自噬，使其恢復至保護性水平，并穩定動力學平衡，從而保護肝細胞乃至其他器官細胞免受損傷，改善患者預后。
結論
本研究不僅確立了Sirt4在膿毒癥急性肝損傷中不可或缺的作用，而且揭示了一種通過抑制由線粒體動力學失衡（包括線粒體分裂增加和融合減少）誘導的線粒體自噬的保護機制。研究結果描繪了一條全新的Sirt4-DRP1-線粒體自噬軸作為膿毒癥肝損傷的關鍵調控機制，提示Sirt4是一個潛在的治療靶點。
