乳腺癌作為全球女性中最常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著女性健康。盡管腫瘤治療領域不斷取得進展，但現有臨床治療模式的效果仍不盡如人意，亟需開發新型高效的腫瘤治療策略。聲動力治療(Sonodynamic Therapy, SDT)作為一種利用超聲波激活聲敏劑產生細胞毒性活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)的非侵入性治療方式，因其優越的組織穿透能力，在深部腫瘤治療中展現出巨大潛力。然而，SDT的療效受到一個核心矛盾的制約：其療效依賴于氧氣供應以產生ROS，而功能失調的腫瘤血管卻形成了嚴重的缺氧微環境，剝奪了治療所必需的反應底物。

盡管近年來SDT已進入初步臨床試驗階段，但其療效尚未達到臨床前研究中的理想水平。超聲波在SDT中通過多種生物效應介導治療作用，其中空化效應(Cavitation Effect)能夠與組織和微泡發生機械相互作用以改善灌注并調節腫瘤微環境(Tumor Microenvironment, TME)，而聲化學效應(Sonochemical Effect)則直接激活聲敏劑產生ROS。當前SDT策略主要采用單次超聲輻照（通常為1 MHz, 1 W/cm², 50%占空比），旨在同時實現聲敏劑的空化輔助遞送和治療性聲化學效應的激活。然而，這種單一參數模式從根本上限制了這些不同超聲生物效應的獨立優化和協同應用。研究表明，相近的超聲參數在輻照微泡產生慣性空化以釋放藥物的同時，也可能損傷血管內皮細胞，誘導血栓形成阻塞血管，從而加劇腫瘤缺氧。這表明現有的單參數范式在實現SDT的同時，可能伴隨著對機體產生不利影響的其他生物效應。

為了克服這些局限性，張澤南等研究人員在《Materials Today Bio》上發表的研究中，提出了一種創新的雙參數序貫超聲輻照策略。研究人員假設，對不同生物效應對應的超聲參數進行優化和組合，對于實現有效且理想的SDT結果至關重要。為此，他們選用傳統光敏劑二氫卟吩e6 (Chlorin e6, Ce6)制備了載Ce6和氧氣的微泡(Ce6 and oxygen-loaded microbubbles, CMO)，并系統探究了引發空化效應和聲化學效應(SDT激活)的最佳超聲參數。該策略分兩個 distinct 階段展開：首先應用低強度空化超聲(Ultrasound for cavitation, US_ca)誘導CMO發生穩定空化，旨在促進血管正常化(Vascular Normalization, VN)、增強腫瘤灌注并特異性緩解缺氧，從而創造有利的TME；隨后施加較高強度的聲化學激活超聲(Ultrasound for sonochemical activation, US_sc)，在預先優化的氧補充環境中觸發聲化學效應，產生大量ROS以實現高效的腫瘤細胞消融。研究評估了這種組合超聲模式相較于傳統單參數策略的抗腫瘤功效，并闡明了治療順序的關鍵作用。

為開展此項研究，作者團隊主要運用了以下關鍵技術方法：研究首先通過薄膜水化-機械振蕩法制備了載Ce6和氧氣的脂質微泡(CMO)，并利用動態光散射、紫外-可見分光光度法、光學顯微鏡及超聲成像等技術對其理化性質（如粒徑、電位、Ce6包封率、穩定性及氧釋放能力）進行了系統表征。在體外實驗中，利用細胞活力檢測(CCK-8法)、活性氧(ROS)熒光探針(DCFH-DA)檢測及活/死細胞染色等方法，優化并驗證了用于誘導空化效應(US_ca)和聲化學效應(US_sc)的超聲參數及其組合的效能。在4T1細胞移植瘤小鼠模型（動物來源：北京維通利華實驗動物技術有限公司）上，通過對比增強超聲成像監測腫瘤灌注變化以評估血管正常化，并采用免疫組織化學/免疫熒光染色（檢測HIF-1α、CD31、α-SMA等標志物）和H&E染色評估腫瘤微環境、血管形態及治療后的組織病理學改變。最后，通過監測腫瘤體積、重量變化以及TUNEL染色檢測細胞凋亡，綜合評價了不同治療方案的體內抗腫瘤效果及生物安全性。

研究人員成功制備了CMO，其在液體中呈綠色懸浮液，光學顯微鏡下分布均勻無團聚。表征結果顯示，合成的CMO粒徑分布為920.7 ± 17.2 nm，zeta電位為0.76 ± 0.44 mV，多分散指數(PDI)為0.18。紫外吸收測量表明CMO和Ce6在662 nm處均有吸收峰，Ce6的包封效率為60.81% ± 4.38%，證實了CMO的成功構建。超聲輻照后，CMO在60秒時出現氧密度峰值，溶解氧濃度為5.25 ± 0.32 mg/L。超聲成像顯示CMO在12小時內保持較高的超聲信號，但其成像持續時間短于僅填充C₃F₈的微泡(MBs@C₃F₈)，表明其穩定性略有降低，可能與Ce6的摻入以及氧氣比C₃F₈更具活性有關。熒光成像證實CMO具有良好的熒光成像效果。這些結果表明CMO具備作為聲敏劑和氧氣載體的基本特性，可用于后續實驗。

研究系統確定了分別用于特異性引發空化效應和聲化學效應(US_sc)的最佳超聲參數。通過監測不同強度（0.4, 0.6, 0.8 W/cm²）超聲輻照下CMO的回波信號變化，發現0.6 W/cm²輻照90秒時，信號衰減后出現平臺期，表明存在穩定的微泡振蕩（穩態空化），適合持續的微環境調節，因此將US_ca定義為0.6 W/cm²，90秒。該參數能有效促進CMO釋放氧氣和Ce6，并增強細胞對Ce6的攝取。在優化US_sc參數時，細胞活力評估顯示，在無CMO條件下，1.6 W/cm²的超聲會引起顯著的細胞死亡（非特異性生物效應），而在有CMO存在時，1.4 W/cm²和1.6 W/cm²引起的聲動力細胞毒性（約70%）無統計學差異，表明SDT效能已在1.4 W/cm²達到最大化。因此，選擇US_sc為1.4 W/cm²，60秒，以實現最大聲化學效能并最小化非特異性超聲毒性。該優化參數在直接SDT(US_sc+ CMO)和模擬序貫治療的mock組（使用經US_ca輻照后的CMO溶液進行US_sc處理）中均能激發強烈的ROS產生和廣泛的細胞死亡，證明了其有效性及聲敏劑在釋放后仍能保持功能活性。

為給后續SDT建立最佳TME，研究評估了優化后的空化參數(US_ca: 0.6 W/cm²)在體內調節腫瘤血管的能力，并與常規單參數SDT常用的聲化學效應參數(US_sc: 1.4 W/cm²)進行對比。腫瘤灌注超聲造影結果顯示，在超聲治療后頭兩天，US_ca+ CMO組的灌注增加，而US_sc+ CMO組的灌注逐漸減少。腫瘤組織H&E染色顯示US_sc+ CMO組存在血管破壞導致的血液漏出。免疫熒光染色（α-SMA標記周細胞，CD31標記內皮細胞）表明，與對照組相比，US_ca+ CMO組CD31表達降低，α-SMA熒光顯著增強，表明未成熟血管減少，成熟血管顯著增加；而US_sc+ CMO組CD31表達顯著降低，血管成熟度降低。缺氧誘導因子-1α (HIF-1α)免疫組化平均光密度(AOD)分析顯示，US_ca+ CMO處理后腫瘤中HIF-1α表達水平顯著低于對照組。這些數據證實，US_ca作為一種有效的預處理手段，能夠重塑TME，增強灌注和氧供，同時最小化血管損傷，為后續SDT創造了理想條件。

體內藥物遞送監測顯示，靜脈注射CMO并經US_ca輻照后，Ce6熒光信號在腫瘤組織4小時即可檢測到，并持續24小時。離體器官熒光成像顯示肝臟和腫瘤中有強熒光信號。抗腫瘤功效評估將荷瘤小鼠分為7組進行不同處理。結果顯示，G7組(US_ca+ CMO + US_sc)的腫瘤生長抑制最顯著，腫瘤體積最小（213 mm³），顯著優于對照組（812 mm³）及其他處理組（如G2組[US_sc+ CMO]為508 mm³）。各組小鼠體重無顯著差異。G7組腫瘤重量降至對照組的46%。H&E和TUNEL染色顯示G7組腫瘤出現顯著壞死、凋亡和增殖抑制。血管評估顯示，G7組血管成熟度顯著高于對照組，而G2組和G4組(US_sc+ CMO + US_sc)的血管密度和成熟度均降低。安全性評估表明，G7組小鼠的肝腎功能指標（AST, BUN, CREA）均在正常范圍內，主要器官組織切片未見顯著炎癥或組織學改變，證明了該序貫超聲策略的生物安全性。

該研究的討論部分深入剖析了其創新性和意義。首先，研究通過參數優化揭示了空化效應和聲化學效應之間存在明顯的"閾值效應"。US_ca在0.6 W/cm²輻照90秒時能達到穩態空化與慣性空化的平衡點，實現持續的微環境調節。而對于US_sc，強度從1.4 W/cm²增至1.6 W/cm²并未顯著增強SDT介導的細胞毒性，卻增加了非特異性生物效應，因此選擇1.4 W/cm²遵循了"最大聲化學效能與最小輔助聲毒性"的原則。

本研究最顯著的創新在于重新定義了空化在SDT中的作用，將其從副作用提升為戰略性預處理手段，以重編程TME。研究明確展示了US_ca預處理能夠誘導功能性血管正常化，改善缺氧，而US_sc單用則會破壞血管。這種對比強有力地驗證了雙參數策略的時間邏輯：微環境調節必須先于破壞性治療。

治療效果的顯著差異，特別是G7組(US_ca+ CMO + US_sc)的卓越抗腫瘤效果，確證了兩個超聲階段的不可或缺的協同作用。關鍵的證據在于，US_ca+ CMO單獨產生的ROS極少，明確表明低強度空化效應不足以激活顯著的聲化學反應。這種功能分離使得US_ca能更專注于通過空化效應增強腫瘤灌注和改善缺氧TME，從而為后續US_sc觸發顯著的ROS風暴奠定基礎。G7組觀察到的優異血管成熟度與US_sc+ CMO同時應用造成的血管損傷形成鮮明對比，這突顯了治療時序的重要性。G7方案中US_ca預處理與US_sc治療間隔24小時是關鍵。鑒于脂質微泡的半衰期短，在施加US_sc時，循環中的CMO已基本被清除，因此后續的US_sc輻照更接近于"單獨US_sc"的條件，后者不會引起顯著的血管破壞。這表明長期的血管表型主要由初始US_ca驅動的正常化過程所塑造和穩定。該設計有效地將空化的有益微環境啟動效應與其與高強度超聲同時應用時可能產生的血管損傷風險解耦。

G2組(單次US_sc+ CMO)與G4組(兩次US_sc+ CMO)效果的對比，進一步揭示了氧氣可用性與SDT療效間的動態相互作用。G2組中，同步的氧氣釋放和Ce6激活允許了短暫但可觀的ROS爆發和抗腫瘤效果。而G4組的第一次US_sc會話可能啟動了血管損傷級聯反應，加劇了后續24小時的缺氧，導致第二次治療時處于氧 deprived 的微環境中，聲化學潛力受限。這反襯出G7序貫策略的優勢：它主動管理了這一挑戰，確保決定性的聲化學攻擊施加于一個準備就緒、氧氣補充充足的目標上。

生物安全性數據支持所選參數（特別是US_sc= 1.4 W/cm²）具有良好的安全性。體外實驗顯示單獨US_sc照射細胞存活率高，體內主要器官無損傷、生化指標正常、體重穩定，表明該強度在US_ca預處理后應用可實現強大而特異的治療效果，且無顯著靶向或脫靶毒性。

研究人員也指出了研究的局限性，例如超聲效應受多種參數（如頻率、占空比）影響，本研究主要聚焦于強度參數的優化組合。腫瘤異質性可能要求超聲參數的動態調整，未來結合人工智能或圖像導航技術有望提升臨床適用性。CMO的長期穩定性、 cationic 微泡的潛在細胞毒性以及材料體系的進一步優化也是未來研究的方向。

綜上所述，本研究通過嚴謹的實驗數據驗證了雙參數序貫超聲輻照模式的科學 rationale 和治療潛力：US_ca驅動的血管正常化與US_sc觸發的聲化學效應協同形成"微環境調控-高效根除"的閉環系統，實現了腫瘤體積的四倍縮減。該策略不僅克服了傳統SDT的療效局限，更為超聲介導的精準治療建立了一個可推廣的范式。通過協調階段特異性且參數調控的生物效應，能夠實現TME重編程和治療效率的質的提升。這一模式與多模態成像引導和智能參數優化相結合，有望成為乳腺癌乃至其他實體瘤治療的新基石。