《Environmental DNA》：Tails of Biodiversity: Vertebrate Community Assessment in a Neotropical River Basin via eDNA Metabarcoding
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本文通過環境DNA（eDNA）宏條形碼技術，首次系統評估了巴西圣安東尼奧河上游源頭溪流的脊椎動物多樣性，揭示了氧化還原電位（ORP）是影響物種豐富度的關鍵環境因子，而非森林覆蓋率或pH值。研究在受采礦活動影響的東西坡地識別出兩個不同的生物群落，累計發現119個脊椎動物分類單元，為這片大西洋森林殘留地的生物多樣性監測與保護決策提供了重要科學依據。
1 引言
人為活動是導致全球生物多樣性喪失的主要驅動力，主要體現在棲息地退化、土地利用變化和氣候變化等方面。這些驅動因素共同作用，加劇了全球物種豐富度的下降。監測生物多樣性趨勢是制定明智保護政策和有效管理策略的基礎步驟。近年來，通過環境DNA（environmental DNA, eDNA）進行生物監測的方法革新了傳統手段。eDNA宏條形碼技術減少了物種鑒定所需的工作量，最大限度地減少了形態學鑒定的挑戰，并且降低了對特定分類學知識的依賴。此外，eDNA能夠同時識別單個環境樣本中的多營養級群落。
盡管大多數應用eDNA方法的研究在溫帶地區開展，但熱帶地區的生物多樣性更高且亟待記錄。由于eDNA能夠提供快速且成本相對較低的評估，它已成為理解新熱帶動物區系高物種豐富度的寶貴工具。
位于巴西東南部的圣安東尼奧河流域是多西河流域最大、最原始支流之一。與多西河其他部分相比，圣安東尼奧河流域的環境退化相對較晚，始于20世紀30年代。采礦活動、人口增長和水電站的建設對該河流的生物多樣性構成了重大威脅。目前，圣安東尼奧河流域大部分高質量的森林殘留地存在于源頭地區，即埃斯皮尼亞蘇山脈的高海拔區域。
本研究利用eDNA分析了圣安東尼奧河源頭溪流中的多營養級脊椎動物群落，包括魚類、兩棲動物、鳥類和哺乳動物。研究假設是，土地利用強度的增加會降低分類學多樣性并改變多營養級脊椎動物群落的結構組成。預測具有較高森林覆蓋率的位點將表現出更高的脊椎動物豐富度。
2 材料與方法
2.1 研究區域
研究在巴西米納斯吉拉斯州圣安東尼奧河流域的三級和四級溪流中進行。該流域面積10429 km2，包含五條主要支流。圣安東尼奧河發源于埃斯皮尼亞蘇山脈，流經約280公里后匯入多西河。該地區氣候屬于溫帶多雨氣候，年平均降水量1314毫米，年平均氣溫在21°C至24°C之間。大約88.6%的圣安東尼奧河流域位于大西洋森林生物群系內，其余11.4%位于塞拉多生物群系。
2.2 采樣設計與eDNA采集
于2023年4月，在圣安東尼奧河上游流域對15條溪流進行了采樣。使用度量均勻設計算法選擇采樣點以減少空間自相關。在每個溪流點，使用5升無菌一次性塑料袋采集三份水樣重復。水樣通過聚醚砜膜過濾器進行過濾，使用電池供電的便攜式蠕動泵作為封閉系統操作以盡量減少污染。每個采樣點使用全新的野外工具包。過濾后，濾膜立即浸入改良的Longmire's緩沖液中以保存DNA。樣品在運輸過程中避光冷藏，隨后在實驗室-80°C保存直至分析。未采集現場空白樣，但通過使用一次性耗材、封閉過濾系統以及在實驗室處理過程中包含提取和PCR空白來彌補此限制。
2.3 測序
使用DNeasy Blood and Tissue提取試劑盒提取eDNA。每個樣品批次包含一個由裂解緩沖液組成的提取空白作為陰性對照。使用針對線粒體12S rRNA基因的引物進行擴增，每個樣品進行12次PCR重復。每個PCR批次包含陰性對照和陽性對照。由于已知這些引物會擴增靈長類DNA，在第一輪PCR中使用阻斷引物來限制非目標人類DNA的擴增。對第二輪（索引）PCR的擴增子進行純化，通過凝膠電泳檢查，并進行定量。使用Illumina MiSeq系統進行測序。
2.4 生物信息學分析
對原始序列進行解復用、合并、引物修剪和質量過濾。然后進行去重復，生成零半徑操作分類單元（zOTUs）。使用UNOISE算法對讀數進行降噪以最小化假陽性。保留的zOTU要求至少在一個樣本中具有不少于8條讀長的最小豐度。使用BLASTn對每個zOTU進行共識分類學分配，搜索NCBI核苷酸數據庫。分類分配需要滿足最低相似度閾值。將高質量序列聚類為操作分類單元（OTUs），并過濾掉低豐度OTUs。對所有具有物種水平鑒定的OTU，查詢IUCN紅色名錄等數據庫以獲取其保護狀態和入侵狀態信息。
2.5 環境變量
在采樣點周圍500米緩沖區內評估土地利用情況，并與MapBiomas項目提供的2022年30米分辨率土地利用和植被地圖疊加。測量了每個點位到最近采礦活動的距離。使用多參數探頭測量每個點位的環境變量，包括電導率（COND）、溶解氧（DO）、pH、氧化還原電位（ORP）、水溫（WT）和氣溫（AT）。
2.6 數據分析
繪制物種累積曲線以估計達到漸近線所需的采樣努力量。使用主成分分析（PCA）評估不同變量如何影響生物群落的分布和組成。計算每個采樣點的多樣性指數。基于S?rensen相異性指數計算總β多樣性，并分解為物種周轉（βSim）和嵌套性（βNes）組分。使用PERMANOVA和db-RDA分析群落組成變異與環境及土地利用預測因子的關系。使用線性混合模型（LMM）模擬脊椎動物豐富度與環境變量的關系。
3 結果
3.1 多營養級群落
通過水樣eDNA測序，在圣安東尼奧河流域揭示了50個科，分屬輻鰭魚綱（Actinopterygii）、兩棲綱（Amphibia）、鳥綱（Aves）和哺乳綱（Mammalia）。未檢測到爬行動物。在15個溪流系統中，共檢測到119個脊椎動物OTUs，包括40個魚類OTUs、12個兩棲動物OTUs、32個鳥類OTUs和35個哺乳動物OTUs，涉及1門、4綱、24目、50科、77屬和62個物種。Chao2估計器表明物種累積曲線未達到漸近線，暗示流域內脊椎動物OTU豐富度可能隨著采樣努力量的增加而翻倍，可能超過240個OTUs。
PCA分析顯示，前兩個主成分解釋了56%的方差。PC1與距采礦點距離、OTU豐富度、ORP呈正相關，與水溫、氣溫呈負相關。PC2與森林覆蓋率、氣溫呈正相關，與人為土地利用比例呈負相關。聚類分析顯示，群落明顯分為兩大組，分別對應于流域西坡的圣安東尼奧克魯塞羅溪和東坡的佩希河。群落組成差異主要受流域坡向、距采礦點距離和ORP的影響。β多樣性分析表明，OTU組成的變化有15%源于總β多樣性，其中10%由物種周轉貢獻，5%由嵌套性貢獻。對于總脊椎動物豐富度，ORP是最強的預測因子，而森林覆蓋率、pH和距采礦點距離則無顯著關聯。按類別分析，魚類和哺乳動物的豐富度隨ORP增加而增加，而兩棲動物和鳥類的豐富度與測試的環境變量均無顯著相關。
3.2 脊椎動物生物多樣性
研究發現40個魚類OTUs，可鑒定為5目13科23屬17種。最具多樣性的魚類科是脂鯉科。約70%的魚類物種在四個或更多位點共享。記錄到9目16科20屬18種鳥類，90%的鳥類OTUs出現在三個或更少的位點。采樣到12個兩棲動物OTUs，屬于1目6科7屬7種。75%的兩棲動物物種僅限于三個或更少的點位。記錄了9目15科27屬20種哺乳動物。站點RS8和RS4的哺乳動物豐富度最高。
3.3 受威脅/外來物種
通過eDNA宏條形碼鑒定的62種脊椎動物中，90%被列為“無危”物種。但也記錄到具有一定威脅程度的物種，例如被世界自然保護聯盟列為“近危”但在米納斯吉拉斯州被視為“易危”的毛鼻水獺。魚類霍氏孔腹魚和食肉動物南美浣熊被列為巴西的外來入侵物種。一些已知存在于該流域的特有和瀕危物種未在本研究中被記錄。
4 討論
4.1 通過eDNA解讀生物多樣性模式
與假設相反，森林覆蓋率并非驅動物種豐富度的主要因素。相反，采礦活動壓力是圣安東尼奧河流域群落組成最一致的影響因子。群落組成在流域間存在差異，并且共同響應空間和環境梯度。氧化還原電位（ORP）對脊椎動物群落表現出獨立影響，是上游圣安東尼奧河流域脊椎動物豐富度的主要預測因子。ORP反映了水生系統氧化或還原化學物質的能力，高ORP通常與更好的水質相關。本研究首次建立了ORP與魚類及其他脊椎動物豐富度的關系。
研究發現圣安東尼奧克魯塞羅溪坡地的群落與佩希河坡地的群落明顯不同，西坡的脊椎動物豐富度更高。下游主河道站點（如RS8/RS4）的較高多樣性符合河流連續體概念（RCC）的預期。然而，物種周轉而非純粹的嵌套性主導了群落組成的變化，表明在RCC梯度之上，局部環境過濾和人為壓力進一步篩選物種，在不同位點產生了不同的組合。
4.2 eDNA與多營養級生物多樣性
圣安東尼奧河流域僅占多西河流域總面積的13%，但擁有多西河最多的本地魚類物種豐富度，被認為是保護魚類多樣性的優先區域。本研究檢測到的魚類科組成與傳統采樣結果一致。兩棲動物的代表性有限，可能與采樣季節有關。鳥類多樣性較高，但爬行動物未被檢測到，可能與eDNA釋放量少、種群密度低以及所用引物非針對該類群優化有關。
4.3 具有保護重要性的物種
利用短DNA片段進行有效物種鑒定需要可靠的已知分類群參考序列庫。參考數據庫的缺乏是eDNA宏條形碼應用的局限性之一，新熱帶動物區系的參考數據庫通常不完整。參考數據庫中缺乏新熱帶多樣性代表序列可能是許多OTU無法鑒定到物種水平的原因之一。此外，需要開發能夠充分識別和區分高度多樣性熱帶類群物種的分子標記。建立條形碼庫、標準化采集協議和開發針對熱帶動物區系的特異性標記對于增強認知和支持保護至關重要。
4.4 保護意義
氣候變化、森林砍伐、景觀破碎化及其他人為威脅正在持續減少全球脊椎動物種群。本研究通過eDNA宏條形碼技術，快速清查了圣安東尼奧河流域一小片離散區域的脊椎動物生物多樣性及其驅動因素。快速測繪有助于應對在物種消失前進行編目的挑戰。
群落在該流域的東西坡表現出明顯的分類學和環境差異。物種周轉是這些群落變異的重要因素。建議該地區的管理和保護策略應考慮對兩個坡地采取不同的方法，并鑒于圣安東尼奧河流域的高度異質性，優先保護多種棲息地。
圣安東尼奧河流域作為多西河流域最大的保存完好的殘留地之一，其生物多樣性本底數據的建立至關重要。這些發現強調了圣安東尼奧河流域作為生物多樣性避難所的重要性，并為保護、恢復和環境監測策略提供了寶貴的見解。
