《Microchemical Journal》：Liquid column and droplets based CRISPR/ AsCas12a-ultra tube microfluidic chip enabling ultra-sensitive and rapid multiplexed pathogen detection
吳尚義|王木珍|徐子禾|劉芳武|董東|黃百成|史新平|闞興琪|黃興旭|吳麗娜|鄭偉波|田雪梅|王新杰
中國農業科學院深圳農業基因組研究所，農業農村部基因組分析與多組學技術國家重點實驗室
摘要
基于CRISPR的檢測平臺顯著提升了快速、精確的核酸（NA）檢測能力，適用于即時檢測（POC）食品安全和疾病診斷。然而，目前仍迫切需要將易于使用的目標富集技術與多目標分析相結合。本文介紹了一種新型的CRISPR/AsCas12a-ultra集成管式閉環微流控芯片生物傳感器（CAT），用于超高靈敏度的多目標檢測。首先，我們開發了一種基于閉環液柱和液滴的ERA/CRISPR/AsCas12a-ultra系統，其檢測靈敏度是傳統CRISPR AsCas12a系統的3倍。其次，我們建立了一個自動化的精密液體操控和實時現場熒光檢測平臺，能夠高效富集并同時檢測8個目標。在最佳條件下，CAT可在35分鐘內自動純化并檢測病原體NA目標，檢測限為0.1拷貝/μL（1拷貝/反應），且熒光強度提高了3倍。該平臺可同時檢測多種腸道病原體，特異性高達100%。總體而言，CAT是一種通用、快速、靈敏的管式微流控平臺，適用于即時檢測（POC）中的多重病原體檢測。
引言
病原體感染對全球公共衛生構成嚴重威脅，通常涉及多種病原體的共存[1]。由霍亂弧菌（Vibrio cholerae）和腸道病毒等引起的腸道感染通過糞-口途徑或密切接觸傳播，主要影響5歲以下兒童和免疫功能低下者[2,3]。高通量檢測系統對于追蹤食品供應鏈中的病原體傳播和耐藥性至關重要，尤其是在發展中國家[4,5]。主流的混合感染檢測系統（如金標準培養法、PCR和下一代測序）具有高準確性的優點。然而，這些系統需要專業技術人員操作昂貴的儀器，耗時較長，并且并非在全球所有疑似病例中都能使用[6,7]。在多重病原體檢測方面，開發一種易于使用、快速、高靈敏度的即時檢測（POC）平臺將具有重大意義。等溫擴增（IA）結合規律間隔短回文重復序列（CRISPR）是一種有前景的快速便捷的核酸檢測策略[8,9]。基于CRISPR/Cas的SherLOCK和DETECTR技術為傳染性和非傳染性疾病的診斷開辟了新途徑[10,11]。然而，有限的靈敏度、特異性和假陽性結果限制了其應用。為解決這些問題，開發高性能的Cas蛋白是實現先進CRISPR核酸酶應用的前提。Lachnospiraceae細菌的Cas12a（LbCas12a）和Acidaminococcus屬的Cas12a（AsCas12a）是目前最常用的Cas蛋白[12]。超靈敏的工程化AsCas12a蛋白與酶促重組擴增（ERA）結合，在臨床應用中已有效用于單拷貝基因的精準檢測[13]。但在一鍋法檢測中，Cas蛋白會形成核糖核蛋白（RNP）復合物，干擾目標NA或擴增子的積累[14]。擴增和檢測步驟的分離增加了復雜性及交叉污染的風險，尤其是在多重目標檢測時。簡化工作流程并減少對復雜儀器的依賴對于更廣泛的應用至關重要。如上所述，包括樣本輸入、DNA提取、IA和CRISPR結果讀取在內的檢測步驟在一個獨立系統中存在挑戰[15]。為克服這些限制，人們開發了新的檢測技術，以避免封閉設備內不同反應系統之間的干擾。將檢測步驟集成到微流控測試平臺中，實現了樣本到結果的快速檢測[16]。微通道、孔洞和液滴的設計用于在微米級腔室內分離IA和CRISPR過程，從而減少NA泄漏[1,17,18]。然而，精確的液體操控和高度復雜的腔室制造進一步增加了簡化封閉設備的難度[16,19]。另一方面，比色微流控生物傳感器因其簡單性、快速性和現場讀數能力而成為有前景的POCT工具[20]。核酸檢測的比色信號放大策略通常依賴于插入染料、酶介導的級聯反應或轉錄和翻譯為酶或其他蛋白質[21,22]。但這些方法受到靈活性限制、需要等溫條件以及背景噪聲等因素的制約[22,23]。因此，迫切需要探索易于使用、靈敏且封閉式的核酸檢測微流控設備。
為了實現高靈敏度的多重病原體通用檢測，我們開發了一種集成的、高通量的、易于使用的微流控芯片實時檢測生物傳感器CAT（基于CRISPR/AsCas12a和管式的微流控芯片生物傳感器）。通過優化硅涂層磁珠（SMBs）、使用硅膠管插座連接的閉環芯片以及實時現場熒光強度收集裝置，降低了POC檢測系統的復雜性，使其更加用戶友好。此外，基于工程化AsCas12a-ultra的ERA/CRISPR系統顯著增強了FAM標記的單鏈DNA探針的切割活性。在這個通用的多重目標檢測平臺中（圖1），泵和閥門自動操控NA提取回路中的液柱和8個并行ERA/CRISPR檢測回路中的即用型分離試劑液滴。在優化了液滴體積閾值和管材后，樣品中的純化DNA與穩定分散的試劑液滴依次混合，引發ERA和CRISPR反應。CAT的檢測限（LoD）為0.1拷貝/μL病原體NA，可同時檢測多達8個目標，為快速、靈敏的現場多重病原體檢測提供了巨大潛力。
材料與試劑
所有試劑的詳細信息見補充材料。
CAT微流控生物傳感器的制造
如圖S1和S2所示，這款完全集成的微流控生物傳感器（長度：30厘米，寬度：20厘米，高度：20厘米）主要由兩部分組成：基于管的微流控芯片和操作平臺。
基于管的微流控芯片包含四個功能部分（圖S1a, b）：(1) 樣本收集管（硅膠管，內徑：3毫米，外徑：5毫米），用于收集MNBs-NA混合物；(2) 洗脫管
CAT生物傳感器的液體流動控制原理
為減少DNA氣溶膠污染并確保可靠的NA檢測結果，自動化、無縫檢測設備中的液體操控由泵和閥門控制。泵和閥門負責操控通道附近的液柱。然而，用于ERA和CRISPR反應的微升級試劑容易形成液滴，界面力會阻礙泵的直接驅動[24]。這給微升級試劑的精確輸送帶來了挑戰。
結論
我們開發了一種完全集成的CRISPR/AsCas12a和基于管的微流控病原體NA檢測生物傳感器（CAT），可在約0.5小時內簡單、靈敏、特異性地檢測多種腸道病原體及含有HPV的臨床宮頸細胞樣本。這款基于常見硅膠管和自動化液滴及液柱操控的閉環液體操作平臺，確保了ERA和CRISPR在單個管內的順序反應，大大簡化了檢測流程。
CRediT作者貢獻聲明
吳尚義：撰寫初稿、驗證、方法學設計、數據整理。
王木珍：可視化處理、驗證、方法學設計、數據分析、數據整理。
徐子禾：撰寫初稿、可視化處理、軟件開發、方法學設計、數據分析。
劉芳武：資源提供、方法學設計、概念構思。
董東：軟件開發、資源提供、方法學設計。
黃百成：驗證工作、資源提供、方法學設計。
史新平：驗證工作、資源提供。
闞興琪：驗證工作
利益沖突聲明
作者聲明沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文的研究結果。
致謝
本工作得到了國家自然科學基金（項目編號：81772533）和國家重點研發計劃（項目編號：2021YFC2103300）的支持。
