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本文報道了CRISPR-Cas系統(tǒng)家族新成員——Cas12a3，其被靶RNA激活后可特異性切割tRNA的3′端CCA尾部，介導(dǎo)獨特的抗噬菌體免疫反應(yīng)。該研究通過生化和結(jié)構(gòu)分析揭示了Cas12a3的tRNA裝載域（tRLD）精準(zhǔn)定位底物的機制，并開發(fā)了基于此特性的多重RNA檢測新工具，為CRISPR工具箱拓展了全新方向。
Cas12a3和Cas12a4可實現(xiàn)無DNA損傷的生長停滯
研究人員通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，在Cas12a2附近存在兩個新的核酸酶分支，分別命名為Cas12a3和Cas12a4。大多數(shù)這些核酸酶與CRISPR陣列以及間隔區(qū)獲取基因cas1、cas2和cas4相關(guān)。與可廣泛切割DNA的Cas12a2不同，Cas12a3和Cas12a4缺乏芳香鉗區(qū)域的關(guān)鍵殘基。在大腸桿菌中進行的功能實驗表明，Cas12a3和Cas12a4在靶RNA激活后能介導(dǎo)生長停滯和噬菌體防御，但不會誘導(dǎo)SOS DNA損傷反應(yīng)，這表明它們通過一種不同于Cas12a2的獨特機制發(fā)揮免疫功能。
活性Cas12a3和Cas12a4切割RNA而非DNA
為了探究Cas12a3和Cas12a4的底物偏好性，研究人員使用了隨機序列的RNA、單鏈DNA（ssDNA）和雙鏈DNA（dsDNA）底物庫進行體外切割實驗。結(jié)果顯示，與Cas12a2激活后非特異性切割所有核酸底物不同，Cas12a3和Cas12a4在靶RNA激活后，僅特異性切割RNA底物庫。值得注意的是，Cas12a3對其靶RNA的切割并不完全，暗示其可能存在更偏好的特異性RNA底物。
Cas12a3偏好切割特定RNA底物
在無細(xì)胞轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)（TXTL）中的實驗進一步揭示了Cas12a3的作用模式。當(dāng)激活的Cas12a3在報告質(zhì)粒加入前預(yù)先孵育于TXTL系統(tǒng)中時，能夠完全抑制后續(xù)GFP報告基因的表達，而Cas12a2則無此效果。這表明Cas12a3可能通過降解對基因表達至關(guān)重要的RNA組分（如tRNA或rRNA）來發(fā)揮作用，而非直接切割靶標(biāo)轉(zhuǎn)錄本。
Cas12a3切割tRNA尾部
為了直接鑒定Cas12a3的生理性RNA底物，研究人員對TXTL反應(yīng)后的RNA進行了納米孔直接RNA測序。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，激活的Cas12a3并未顯著切割rRNA或靶RNA，而是特異性地切割了多種tRNA的3′端，切割位點通常位于保守的3′ CCA尾部上游2-4個核苷酸處。Northern印跡分析證實了特定tRNA的切割。使用純化的大腸桿菌總tRNA進行的體外實驗表明，Cas12a3可切割幾乎所有的tRNA，主要發(fā)生在tRNA 3′末端上游三到五個核苷酸的位置。即使tRNA帶有氨基酸或化學(xué)修飾，Cas12a3依然能夠有效切割。與之相比，Cas12a4則表現(xiàn)出不同的tRNA切割模式。這些結(jié)果表明，激活的Cas12a3核酸酶優(yōu)先切割tRNA的3′尾部，同時保留結(jié)合的靶RNA，從而將其與Cas12a2和Cas12a4區(qū)分開來。
研究人員還將Cas12a3與已知可切割tRNA反密碼子環(huán)的LshCas13a進行了比較。雖然兩者在TXTL中都能有效抑制GFP表達，但RT-qPCR顯示只有LshCas13a會切割gfp轉(zhuǎn)錄本，而Cas12a3不切割靶RNA，進一步突出了其作用機制的差異性。此外，實驗表明Cas12a3介導(dǎo)的免疫防御不依賴于RelA介導(dǎo)的嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)，其生長停滯可能源于翻譯的直接中斷或由tRNA切割產(chǎn)物誘導(dǎo)的其他應(yīng)激反應(yīng)。
tRNA通過裝載域進行定位
通過微量熱泳動技術(shù)證實，純化的Ba1Cas12a3能強烈結(jié)合crRNA、靶RNA以及激活后的tRNA。利用單顆粒冷凍電鏡技術(shù)，研究人員解析了Ba1Cas12a3與crRNA、靶RNA和tRNAAla(UGC)形成的四元復(fù)合物結(jié)構(gòu)，分辨率達到3.1 ?。結(jié)構(gòu)顯示，Ba1Cas12a3包含一個REC葉和一個NUC葉，其插入結(jié)構(gòu)域的一部分（殘基855-960）與其他已知蛋白無同源性，被命名為tRNA裝載域（tRLD），該結(jié)構(gòu)域直接與tRNA相互作用。結(jié)構(gòu)分析揭示了tRNA的兩個關(guān)鍵接觸點：其T臂與REC2域的一個環(huán)相互作用；而其接受莖和3′ CCA尾部則被夾在tRLD和RuvC結(jié)構(gòu)域之間，使得tRNA尾部定位于RuvC核酸酶活性位點。
利用截短的tRNA底物進行的突變分析表明，tRLD以及REC2環(huán)中與T臂相互作用的殘基對于tRNA的有效切割至關(guān)重要。突變tRLD中與末端腺苷堆疊的殘基（如R902或N924）會顯著降低tRNA切割活性。這些發(fā)現(xiàn)表明，Ba1Cas12a3通過REC2環(huán)和tRLD的形狀特異性及電荷特異性相互作用，將tRNA的接受莖和3′ CCA尾部精準(zhǔn)定位到RuvC活性位點，從而實現(xiàn)對游離tRNA的優(yōu)先切割。
結(jié)構(gòu)變化 enabling tRNA結(jié)合
為了深入理解Cas12a3的激活和切割機制，研究人員解析了其與crRNA結(jié)合的二元復(fù)合物、與crRNA和靶RNA結(jié)合的三元復(fù)合物以及與切割后的tRNA尾部結(jié)合的四元復(fù)合物等一系列冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)揭示了Cas12a3在靶RNA識別后發(fā)生的一系列構(gòu)象變化。從二元結(jié)構(gòu)開始，靶RNA結(jié)合驅(qū)動Cas12a3和crRNA發(fā)生構(gòu)象變化，REC2結(jié)構(gòu)域移動28 ?以容納向?qū)?靶標(biāo)雙鏈體。在三元復(fù)合物中，tRLD雖然靠近RuvC活性位點，但靈活性增加。在切割tRNA尾部后，切割產(chǎn)物（5′-ACCA-3′）仍然楔在RuvC和tRLD結(jié)構(gòu)域之間，使Cas12a3保持激活構(gòu)象，從而可能無需構(gòu)象重置即可連續(xù)捕獲和切割其他tRNA。這些結(jié)構(gòu)快照共同揭示了Cas12a3在靶RNA識別后，利用其獨特的tRLD引導(dǎo)切割tRNA 3′ CCA尾部的激活路徑。
Cas12a3擴展多重RNA檢測能力
Cas12a3的特異性切割活性為其在多重RNA檢測中的應(yīng)用提供了可能。研究人員設(shè)計了一種模擬tRNA接受莖和尾部的合成報告分子（如h25），該報告分子在Cas12a3激活時能被高效切割。重要的是，Cas12a3對其報告分子的偏好性與Cas13a（偏好富含U的序列）和Cas13b（偏好富含A的序列）核酸酶正交。利用這一特性，研究人員將Cas12a3、Cas13a和Cas13b核酸酶及其各自的報告分子（標(biāo)記不同熒光基團）整合到一個反應(yīng)體系中，實現(xiàn)了對SARS-CoV-2、呼吸道合胞病毒（RSV）和甲型流感病毒RNA轉(zhuǎn)錄本的多重、一鍋法檢測。即使存在大量人總RNA背景，檢測也不受干擾甚至有所增強。這表明Cas12a3可以很容易地與廣泛使用的Cas13平臺整合到多重檢測方法中。
討論
本研究報道了CRISPR-Cas系統(tǒng)的一個新功能分支——Cas12a3。其在crRNA引導(dǎo)下識別互補靶RNA后，并非直接切割靶標(biāo)或非特異性降解核酸，而是特異性地切割細(xì)胞tRNA庫中保守的3′ CCA尾部，從而通過破壞翻譯機制誘導(dǎo)生長停滯并阻斷噬菌體傳播。與通常靶向tRNA反密碼子環(huán)的先天免疫機制不同，Cas12a3對tRNA尾部的切割是一種更為根本且不易被病毒規(guī)避的策略。結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究揭示了其獨特的tRNA裝載域（tRLD）在底物識別和定位中的關(guān)鍵作用。此外，該研究還成功將Cas12a3的特異性應(yīng)用于開發(fā)新型多重RNA診斷工具。這項工作不僅發(fā)現(xiàn)了一種以前未被認(rèn)識的基于CRISPR的免疫策略，揭示了Cas12核酸酶功能多樣性的新維度，而且為CRISPR技術(shù)工具箱增添了具有獨特應(yīng)用前景的新成員，尤其在多重生物傳感和潛在的治療干預(yù)方面。對PFS識別和tRNA結(jié)合機制的結(jié)構(gòu)洞察也為進一步工程化改造Cas12a3奠定了基礎(chǔ)。
