準(zhǔn)確高效的臨床樣本分析在生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)診斷中起著至關(guān)重要的作用。循環(huán)體液中的核酸（如ctDNA、mRNA和miRNA）是寶貴的生物標(biāo)志物，能夠?qū)崿F(xiàn)遺傳疾病的動(dòng)態(tài)實(shí)時(shí)監(jiān)測、傳染病的預(yù)防以及腫瘤免疫療法的進(jìn)步。通過液體活檢對這些分子進(jìn)行定量分析具有顯著優(yōu)勢，包括相對的分子穩(wěn)定性、非侵入性以及可重復(fù)采樣的可能性[1]。在過去的幾十年里，定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）由于其在核酸擴(kuò)增方面的卓越靈敏度和可靠性，已成為分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。為了克服與熱循環(huán)相關(guān)的儀器和技術(shù)限制，人們開發(fā)了一系列等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）和滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）[3]、[4]。隨著對先進(jìn)生物分析工具需求的增長以及全球健康挑戰(zhàn)（如COVID-19大流行）的持續(xù)存在[2]，該領(lǐng)域最近取得了進(jìn)展，這些進(jìn)展旨在實(shí)現(xiàn)超高靈敏度、特異性和多功能性，同時(shí)個(gè)性化診斷在中心實(shí)驗(yàn)室和即時(shí)檢測（POC）環(huán)境中也得到了快速發(fā)展。

成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列（CRISPR）系統(tǒng)最初在細(xì)菌中被發(fā)現(xiàn)，其功能在于識別特定核酸序列后激活核酸酶，并已成為具有多種生物功能的強(qiáng)大分子工具[5]。由于CRISPR系統(tǒng)的卓越效率、精確性和可編程性，它們已經(jīng)發(fā)展成為一種變革性的工具包，在基因工程、生物成像和體外診斷（IVD）中有著廣泛的應(yīng)用[6]。其中，Cas12a和Cas13a能夠精確識別目標(biāo)核酸并介導(dǎo)位點(diǎn)特異性的順式切割，隨后觸發(fā)對單鏈DNA或RNA的強(qiáng)效非特異性反式切割活性[7]、[8]。利用這些優(yōu)越特性，已經(jīng)建立了多種基于CRISPR的即時(shí)檢測（POCT）平臺，包括DETECTR（DNA內(nèi)切酶靶向CRISPR轉(zhuǎn)錄報(bào)告系統(tǒng)）[9]、HOLMES（低成本多功能高效系統(tǒng)）[10]和SHERLOCK（高靈敏度酶報(bào)告系統(tǒng)）[11]，用于靈敏且準(zhǔn)確地檢測DNA和RNA。與傳統(tǒng)依賴昂貴儀器和熟練人員的PCR方法相比，CRISPR/Cas檢測方法操作簡便，便于開發(fā)便攜式即用型診斷試劑盒。然而，基于CRISPR的技術(shù)尚未像PCR那樣在臨床上得到廣泛應(yīng)用，主要是由于其靈敏度存在固有限制。在臨床樣本中，ctDNA、miRNA和病毒RNA等核酸生物標(biāo)志物的濃度通常非常低，常常低于CRISPR/Cas系統(tǒng)的檢測閾值[9]、[12]、[13]。為了解決這一挑戰(zhàn)，人們通過蛋白工程、crRNA修飾、報(bào)告基因優(yōu)化以及添加化學(xué)物質(zhì)或緩沖液等方式，致力于提高Cas蛋白的crRNA觸發(fā)反式切割活性，這些措施共同顯著提升了檢測靈敏度。CRISPR系統(tǒng)的模塊化結(jié)構(gòu)使得這些策略能夠協(xié)同作用，有可能將其分析靈敏度推向理論極限。因此，及時(shí)且系統(tǒng)地回顧這些進(jìn)展對于全面了解當(dāng)前進(jìn)展、評估現(xiàn)有方法的優(yōu)缺點(diǎn)以及加速基于CRISPR的診斷技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化至關(guān)重要。

本文總結(jié)了在無擴(kuò)增條件下提高CRISPR/Cas檢測靈敏度的現(xiàn)有策略，特別是那些使用Cas12和Cas13的方法。開發(fā)更有效的策略來增強(qiáng)Cas的反式切割活性需要全面理解該蛋白的結(jié)構(gòu)和機(jī)制基礎(chǔ)。為此，我們以Cas12a為例，說明了CRISPR系統(tǒng)的分子結(jié)構(gòu)和激活機(jī)制。本節(jié)探討了CRISPR/Cas的分類和結(jié)構(gòu)特征、從crRNA結(jié)合到目標(biāo)搜索的酶促途徑，以及RuvC催化域在介導(dǎo)反式切割活性中的功能作用。基于這一機(jī)制理解，我們總結(jié)了提高內(nèi)在檢測靈敏度的五個(gè)關(guān)鍵要素，包括Cas蛋白工程、crRNA或DNA修飾、報(bào)告基因底物優(yōu)化、反應(yīng)添加劑以及酶級聯(lián)耦合（圖1）。最后，我們討論了開發(fā)超靈敏CRISPR/Cas技術(shù)的剩余挑戰(zhàn)和新興機(jī)遇，強(qiáng)調(diào)了它們在推進(jìn)臨床診斷和實(shí)現(xiàn)下一代生物傳感策略方面的潛力。