《Translational Oncology》：Single-cell analysis identifies a stemness-associated tumor cell subpopulation and develops a prognostic scoring model in esophageal squamous cell carcinoma
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本研究針對食管鱗癌(ESCC)高度異質(zhì)性及預(yù)后差的問題，通過單細(xì)胞RNA測序技術(shù)鑒定出具有干細(xì)胞特性的腫瘤亞群，并構(gòu)建干細(xì)胞相關(guān)評分模型(SASM)。研究發(fā)現(xiàn)高SASM評分預(yù)示不良預(yù)后、免疫浸潤減少及腫瘤突變負(fù)荷(TMB)升高，同時鑒定TFDP1為關(guān)鍵促癌基因。該研究為ESCC精準(zhǔn)治療提供了新靶點和預(yù)后評估工具。
食管癌作為全球常見的消化道惡性腫瘤，其預(yù)后極差，五年生存率長期低于20%。中國更是食管癌高發(fā)國家，其中食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)占比超過90%。盡管手術(shù)、放化療、靶向治療和免疫治療等多學(xué)科治療策略不斷進步，但ESCC患者的總體治療效果仍不理想。這種治療困境主要歸因于腫瘤的高度異質(zhì)性、侵襲性生物學(xué)行為以及多數(shù)患者確診時已屬晚期。
腫瘤異質(zhì)性是影響ESCC治療反應(yīng)和臨床結(jié)局的關(guān)鍵因素。越來越多的證據(jù)表明，腫瘤由具有不同功能狀態(tài)的細(xì)胞亞群組成，其中一些腫瘤細(xì)胞具有干細(xì)胞樣特性（干細(xì)胞特性），如自我更新、高增殖能力和分化潛能。這些干細(xì)胞相關(guān)腫瘤細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、進展、轉(zhuǎn)移、治療抵抗和復(fù)發(fā)中起著核心作用。然而，干細(xì)胞相關(guān)腫瘤細(xì)胞亞群在ESCC中的分子特征和臨床意義尚不清楚，如何將單細(xì)胞水平的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為臨床可用的預(yù)后預(yù)測和免疫分層工具，也成為該領(lǐng)域亟待解決的科學(xué)問題。
在這項發(fā)表于《Translational Oncology》的研究中，研究人員利用單細(xì)胞RNA測序技術(shù)，系統(tǒng)分析了ESCC腫瘤組織的細(xì)胞異質(zhì)性，識別出八個腫瘤亞群，其中一類細(xì)胞簇表現(xiàn)出顯著的干細(xì)胞樣和增殖特征，高表達(dá)MKI67、STMN1和UBE2C等基因。基于這一干細(xì)胞樣亞群的標(biāo)志基因，研究團隊建立了一個干細(xì)胞相關(guān)評分模型(SASM)，并在獨立的TCGA和GSE53624隊列中驗證了該模型的預(yù)后預(yù)測價值。
研究采用的關(guān)鍵技術(shù)方法包括：從TISCH數(shù)據(jù)庫獲取ESCC單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(GSE160269)，使用Seurat軟件進行質(zhì)控、標(biāo)準(zhǔn)化和細(xì)胞聚類；通過inferCNV算法鑒定惡性上皮細(xì)胞；利用Monocle2進行偽時間軌跡分析；整合TCGA和GSE53624批量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用ComBat算法校正批次效應(yīng)；通過LASSO-Cox回歸構(gòu)建預(yù)后模型；使用CIBERSORT、xCell和ESTIMATE算法評估免疫浸潤和腫瘤微環(huán)境特征；通過體外功能實驗驗證關(guān)鍵基因TFDP1的生物學(xué)功能。
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析揭示細(xì)胞組成和變化
通過單細(xì)胞RNA測序分析ESCC腫瘤組織和配對正常組織，研究人員系統(tǒng)解析了腫瘤微環(huán)境的細(xì)胞景觀和異質(zhì)性。基于經(jīng)典標(biāo)志基因的表達(dá)分布，準(zhǔn)確識別了十三種主要細(xì)胞類型。比較腫瘤與正常組織中細(xì)胞類型比例發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中多個細(xì)胞亞群的浸潤有增加趨勢，特別是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)和上皮細(xì)胞，盡管統(tǒng)計學(xué)上未達(dá)到顯著差異。這些結(jié)果表明ESCC腫瘤表現(xiàn)出高度異質(zhì)的細(xì)胞組成，特定亞群在腫瘤微環(huán)境中的富集趨勢為深入研究其在ESCC發(fā)生發(fā)展中的作用提供了方向。
癌癥干細(xì)胞亞群和功能異質(zhì)性
通過inferCNV算法區(qū)分惡性上皮細(xì)胞，并進行無監(jiān)督聚類和通路富集分析，研究發(fā)現(xiàn)cluster 1特征性高表達(dá)UBE2C、MKI67和STMN1等典型增殖相關(guān)基因。與已建立的標(biāo)志物和相關(guān)文獻比較表明，cluster 1也高表達(dá)癌癥干細(xì)胞(CSC)特征基因，并富集于干細(xì)胞相關(guān)通路，表明cluster 1代表一個癌癥干細(xì)胞亞群。 hallmark通路富集分析顯示，cluster 1在細(xì)胞周期、G2M檢查點和E2F靶標(biāo)通路中具有最高的富集分?jǐn)?shù)，同時表現(xiàn)出上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和WNT通路的高活性，進一步支持其作為癌癥干細(xì)胞群的身份。
偽時間軌跡中腫瘤細(xì)胞亞群的動態(tài)和增殖基因表達(dá)下降
通過Monocle2算法對惡性上皮細(xì)胞進行偽時間軌跡分析，揭示了清晰的分支結(jié)構(gòu)。其中，具有干細(xì)胞樣特性的cluster 1主要分布在偽時間軌跡的早期階段。隨著偽時間的推進，cluster 1細(xì)胞比例逐漸減少，表明從干細(xì)胞樣狀態(tài)向更分化的腫瘤細(xì)胞亞型轉(zhuǎn)變。增殖相關(guān)基因分析表明，MKI67和STMN1的表達(dá)水平均沿偽時間軸逐漸下降，表明隨著惡性上皮細(xì)胞從干細(xì)胞樣狀態(tài)向分化表型轉(zhuǎn)變，其增殖活性相應(yīng)降低。
干細(xì)胞相關(guān)評分模型(SASM)的構(gòu)建和驗證
整合GSE53624和TCGA隊列后，基于干細(xì)胞富集腫瘤細(xì)胞亞群的標(biāo)志基因構(gòu)建并驗證了SASM模型。主成分分析(PCA)顯示批次校正后隊列間樣本明顯重疊，證實了數(shù)據(jù)整合的有效性。單變量Cox回歸分析確定了一系列預(yù)后風(fēng)險和保護因子，LASSO回歸進一步篩選出最具信息量的基因用于模型構(gòu)建。多變量Cox回歸證實了這些基因的獨立預(yù)后價值。Kaplan-Meier生存分析表明，按SASM評分分層的高風(fēng)險組患者總生存期顯著較差。時間依賴性ROC曲線分析顯示SASM模型具有穩(wěn)健的預(yù)測性能。
高低SASM組間不同的免疫微環(huán)境和預(yù)后意義
細(xì)胞浸潤分析顯示，低SASM組漿細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤顯著更高，表明抗腫瘤免疫反應(yīng)更強。相比之下，高SASM組免疫細(xì)胞浸潤水平普遍較低。腫瘤微環(huán)境特征方面，SASM評分與StromalScore、ImmuneScore和ESTIMATEScore呈中度負(fù)相關(guān)，與TumorPurity呈正相關(guān)。突變分析顯示高低SASM組間腫瘤突變負(fù)荷(TMB)無顯著差異，但按SASM評分和TMB分層后，高SASM和高TMB亞組患者總生存最差。
SASM評分與腫瘤生物通路、癌癥-免疫循環(huán)和藥物敏感性譜的關(guān)聯(lián)
SASM評分升高與多種致癌通路的激活顯著相關(guān)，特別是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和血管生成等促瘤通路呈正相關(guān)，而與脂肪酸代謝和氧化磷酸化等抗腫瘤代謝通路呈負(fù)相關(guān)。癌癥-免疫循環(huán)分析表明，SASM評分與免疫反應(yīng)的大多數(shù)步驟負(fù)相關(guān)，特別是T細(xì)胞招募和腫瘤細(xì)胞毒性殺傷相關(guān)步驟。藥物敏感性分析顯示，高SASM評分患者可能對多種化療和靶向藥物更敏感。
TFDP1上調(diào)促進增殖和不良預(yù)后
相關(guān)性分析顯示，TFDP1與SASM評分呈最強正相關(guān)。生存分析顯示TFDP1高表達(dá)患者總生存較差。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qPCR驗證均表明TFDP1在腫瘤組織中顯著上調(diào)。基因敲低實驗表明，TFDP1沉默顯著抑制ESCC細(xì)胞增殖和克隆形成能力。
該研究通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)系統(tǒng)描繪了ESCC微環(huán)境和干細(xì)胞相關(guān)亞群的組成及功能特征，深化了對腫瘤異質(zhì)性機制的理解。研究的創(chuàng)新之處在于構(gòu)建了一個具有臨床轉(zhuǎn)化潛力的預(yù)后評估模型SASM，該模型不僅能夠有效預(yù)測患者預(yù)后，還與腫瘤免疫微環(huán)境特征、致癌通路活化和藥物敏感性密切相關(guān)。特別值得關(guān)注的是，研究鑒定出TFDP1作為關(guān)鍵分子，其高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)且促進腫瘤細(xì)胞增殖，為ESCC的分子分層和靶向治療提供了新方向。
這些發(fā)現(xiàn)對ESCC臨床實踐具有重要啟示：SASM評分系統(tǒng)可作為預(yù)后評估的有力工具，幫助識別高風(fēng)險患者；基于干細(xì)胞特性的免疫微環(huán)境特征分析為免疫治療策略的選擇提供了新思路；TFDP1作為潛在治療靶點的發(fā)現(xiàn)，為開發(fā)新的靶向治療方法奠定了基礎(chǔ)。未來研究通過整合更大規(guī)模多中心隊列、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和多組學(xué)技術(shù)，有望進一步闡明ESCC異質(zhì)性的進化動力學(xué)，加速個體化精準(zhǔn)治療的發(fā)展。
