《Vaccine》：A novel calcium influx inducer and a TLR7 agonist are synergistic co-adjuvants that enhance cross-reactive immunity against influenza in young and aged mice
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疫苗佐劑協同效應增強流感免疫應答：1V270（TLR7激動劑）與2G272（鈣動員誘導劑）組合顯著提升H1N1滅活病毒抗原的IgG1/IgG2a抗體水平及HA抑制滴度，促進淋巴結 germinal center形成，并誘導H1特異性T細胞分泌IFNγ。交叉免疫反應顯示對H5/H3等不同HA株的抗體和細胞免疫廣譜性，尤其適用于老年小鼠。
橫山由美|姚詩音|科扎·雷娜|吉爾·費爾南多|麥克勞克林·伊恩|安圭亞諾·奎羅茲·保拉|布朗·泰勒|舒克拉·尼昆杰·M.|陳邁克爾|梅瑟·凱倫|普米尼亞|科爾·馬里帕特|卡森·丹尼斯·A.|林田智子
加利福尼亞大學圣地亞哥分校醫學院，9500 Gilman Dr，拉霍亞，CA 92093-0809，美國
摘要
疫苗佐劑在疫苗的有效性中起著關鍵作用，尤其是在免疫功能低下的人群中。為了有效抵御新出現的病原體及其變異株，需要新的佐劑和組合策略。本文報道了兩種佐劑的協同組合所帶來的益處：一種Toll樣受體7激動劑1V270和一種鈣離子內流誘導劑2G272，它們分別能引發Th1和Th2類型的免疫反應。在體外實驗中，2G272顯著增強了1V270在人類和小鼠原代細胞中誘導的細胞因子產生，相比其結構-活性關系研究中發現的低活性類似物2E281效果更明顯。以A/California/07/2009（H1N1）滅活流感A病毒（IIAV）作為抗原，這種組合佐劑（2G272 + 1V270）增強了針對血凝素（HA）的IgG1和IgG2a反應，同時提高了血凝素抑制滴度，并增加了免疫BALB/c小鼠淋巴結中的生發中心形成，其效果與FDA批準的佐劑MF59和AS01B相當。該組合佐劑還增強了H1 HA特異性T細胞反應，增加了抗原特異性IFNγ的分泌。重要的是，2G272 + 1V270組合佐劑還促進了對其他H1組（H5、H11）和H2組（H3）血凝素的交叉反應性抗體和細胞免疫反應。C57BL/6老年小鼠接種H1N1 IIAV和2G272 + 1V270后產生了顯著的抗H1 IgG1反應和IFNγ脾臟T細胞反應，這些反應對H5和H3血凝素也具有交叉反應性。總體而言，我們的發現表明2G272 + 1V270可能是一種多功能疫苗佐劑系統，能夠促進更廣泛的Th1/Th2免疫反應和強大的生發中心B細胞形成，包括在老年人群中。
引言
針對傳染病的疫苗對于改善醫療保健和人群健康管理至關重要。流感疫苗可以減少感染的發生率和嚴重程度，并預防流感相關的并發癥，如細菌性肺炎和器官衰竭[1]。作為一種公共衛生措施，為大量人群接種疫苗還可以促進群體免疫，從而保護那些因免疫缺陷而無法有效接種疫苗的人[2]。通過防止病原體的傳播，疫苗還能減緩新變種和突變體的出現，從而促進整體公共衛生，并帶來經濟效益[[2]、[3]、[4]]。
流感疫苗在全球范圍內使用，但在免疫功能低下的人群（如老年人和糖尿病患者）中并不能提供完全的保護[5]。需要改進疫苗以增強免疫反應的持久性和廣度，從而提供對更廣泛流感病毒株的長期保護。為了有效解決這些免疫效果上的不足，疫苗佐劑已成為研究的熱點領域。新型佐劑可以通過單獨使用或與現有佐劑（如單磷酸脂質A（MPLA）、MF59或AS01B）聯合使用，來彌補傳統佐劑（例如明礬）的缺陷[[6]、[7]、[8]、[9]、[10]]。
佐劑的協同組合還可以刺激不同類型的免疫反應極化，這可能會使結果變得復雜。目前的流感疫苗主要誘導針對血凝素（HA）頭部結構域表位的體液反應[11]。這些抗原區域高度變異，并且不斷發生抗原漂移[12]。合理的疫苗設計主要集中在年度流感疫苗中的抗原上，但生成對疫苗中不存在的多種HA抗原具有交叉反應性的反應將有助于提高對年度HA蛋白變異的保護效果。我們改進疫苗保護效果的一般方法是開發組合佐劑，通過互補的信號受體或途徑激活先天免疫細胞，從而增強抗原呈遞細胞（APC）（如樹突狀細胞）的效能。一個例子是低分子量合成佐劑的組合，它們能夠激活Toll樣受體4（TLR4）和TLR7，作為流感病毒蛋白的強效佐劑，誘導快速而持久的抗體反應，對同源和異源小鼠模型中的流感病毒具有保護作用[13,14]。
通過高通量篩選（HTS）和結構-活性關系（SAR）研究，我們最近報道了一系列通過增加鈣離子動員來支持APC功能的化合物[15,16]。當2G272作為單一佐劑使用時，它可以增強抗原特異性抗體反應，并偏向Th2相關的免疫反應[15,16]。我們之前對1V270（一種磷脂偶聯的TLR7激動劑）的研究表明，該化合物能夠強烈產生Th1細胞免疫和相關體液反應[13,14]。在這項研究中，我們進一步在體外和體內檢驗了2G272作為單一佐劑以及與1V270聯合使用的佐劑效果，目標抗原是A/California/07/2009（H1N1）滅活流感A病毒（IIAV），在年輕和老年小鼠中進行了實驗。
化學合成
主要化合物2G272及其低活性類似物2E281是在我們的實驗室合成的。除非另有說明，試劑均從商業供應商處購買，并直接使用，無需進一步純化。溶劑從Fisher Scientific（Waltham, MA）購買，或在使用前重新蒸餾并加入適當的干燥劑。2G272和2E281的儀器分析、合成和NMR分析按照之前的方法進行[16]。
動物
6至8周大的雌性動物
2G272在人類原代細胞中刺激細胞因子釋放
通過廣泛的高通量篩選（HTS）和結構-活性關系（SAR）研究，我們選擇了2G272作為主要化合物，并確定了2E281作為同一化學類型的低活性類似物，用作陰性對照化合物（圖1A）。通過使用原代小鼠和人類免疫細胞進行的細胞因子和趨化因子釋放測定，確認了2G272作為先天免疫激活劑的效力（圖1B-I）。
2G272從10 μM開始連續稀釋兩倍，然后與mBMDC（BALB/c）或hPBMC共培養
討論
面對不斷出現的傳染性病原體對公共衛生的挑戰，有必要開發能夠擴大和增強免疫反應的現代佐劑，特別是在脆弱人群中。大多數佐劑作為免疫刺激劑發揮作用，通過觸發炎癥小體或靶向TLR和其他模式識別受體來誘導APC的成熟和激活。總體而言，這一過程促進了
CRediT作者貢獻聲明
橫山由美：撰寫——審閱與編輯，撰寫——初稿，數據分析，概念構思。姚詩音：撰寫——審閱與編輯，數據分析。科扎·雷娜：撰寫——審閱與編輯，數據分析。吉爾·費爾南多：撰寫——審閱與編輯，數據分析。麥克勞克林·伊恩：數據分析。安圭亞諾·奎羅茲·保拉：數據分析。布朗·泰勒：數據分析。舒克拉·尼昆杰·M：撰寫——審閱與編輯，數據分析，概念構思。陳邁克爾：撰寫——審閱與
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的競爭性財務利益或個人關系，這些關系可能會影響本文所述的工作。
致謝
我們感謝Sandhya S. Bhaskaran、Jeffrey Sheng和Christine Lee（加州大學圣地亞哥分校）提供的實驗支持。這項工作得到了美國國立衛生研究院的資助，合同編號為75N93019C00042（DAC）。本出版物的內容不一定反映衛生與公共服務部的觀點或政策，提及商品名稱、商業產品或組織并不意味著得到美國政府的認可。
