《Vaccine》：Comprehensive characterization of multivalent mRNA vaccines functionality by flow cytometry and mass spectrometry
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本研究針對mRNA疫苗體外生物活性評估中抗體依賴方法的局限性，開發了基于iMFI（整合中位熒光強度）的流式細胞術和LC-MS/MS（液相色譜-串聯質譜）兩種平臺化分析方法。通過系統比較不同封裝率、mRNA比例和完整度的多價mRNA疫苗樣本，證實iMFI能更全面反映蛋白表達水平，且質譜法與抗體法結果高度一致。該研究為mRNA疫苗功能評估提供了可量化、無抗體依賴的新策略，顯著提升了分析方法開發效率。
隨著COVID-19疫情催生mRNA疫苗技術的快速發展，如何準確評估這類新型疫苗的體外生物活性成為行業面臨的重要挑戰。與傳統疫苗不同，mRNA疫苗通過脂質納米粒（LNP）遞送遺傳物質，在細胞內表達靶蛋白進而激發免疫反應，這種多步驟的作用機制使得其功能評估尤為復雜。目前主流方法依賴特異性抗體檢測轉染效率，但僅通過陽性細胞百分比無法區分不同樣本間的蛋白表達水平差異，且抗體開發周期長、適用性受限。來自賽諾菲巴斯德研究所的研究團隊在《Vaccine》發表論文，系統比較了流式細胞術（FCM）和液相色譜-質譜聯用（LC-MS）兩種技術平臺在評估多價mRNA疫苗功能方面的表現。
研究團隊首先建立了基于HEK293T/17細胞模型的轉染實驗體系，通過設計不同封裝率、mRNA組分比例和降解程度的mRNA-LNP樣本，系統評估了三種流式檢測參數（陽性細胞百分比、中位熒光強度MFI、整合中位熒光強度iMFI）的區分能力。實驗顯示，當樣本中游離mRNA比例增加時，三種參數均能通過劑量反應曲線的EC50偏移反映封裝率下降，且保持平行性，符合相對效價計算要求。然而在比較二價與四價疫苗時，雖然陽性細胞百分比曲線平行，但iMFI揭示了兩者在最高表達水平的顯著差異，表明mRNA相對含量直接影響單細胞蛋白產量。在降解實驗中，iMFI能靈敏檢測到早期降解（50%以內）導致的表達強度下降，而僅在嚴重降解時影響轉染效率。
關鍵技術方法包括：1）建立基于HEK293T/17細胞的mRNA-LNP轉染模型，通過梯度稀釋獲得劑量反應曲線；2）流式細胞術同步檢測轉染效率（陽性細胞%）和表達強度（MFI），計算iMFI（陽性細胞% × MFI）；3）基于LC-MS/MS的絕對定量法，使用AQUA肽段作為內標定量靶蛋白；4）通過加速穩定性實驗（-80°C至+37°C儲存）評估方法靈敏度。
在"3.1. 封裝率與mRNA-LNP相對效價相關"部分，研究通過將游離mRNA按比例摻入封裝樣本，證實游離mRNA不引起蛋白表達，且封裝率下降導致的效價降低在所有流式參數中均呈現良好線性相關（R2>0.96）。"3.2. 相對mRNA量影響最大蛋白表達強度"顯示，雖然二價與四價疫苗的轉染效率曲線平行，但前者MFI峰值是后者的兩倍，表明iMFI能捕捉mRNA劑量對表達強度的調控。"3.3. mRNA-LNP降解誘導最大蛋白表達強度降低"發現，降解程度與iMFI的峰值下降呈指數關系，而轉染效率僅在降解超過50%時受影響。"3.4. 液相色譜-質譜聯用顯示與iMFI可比的結果"通過室溫降解實驗，證實LC-MS檢測的蛋白絕對定量值與iMFI變化趨勢一致，且信噪比更優。"3.5. 質譜可用于研究mRNA-LNP降解"進一步在-80°C和+37°C穩定性實驗中驗證兩種方法的一致性，表明降解主要影響蛋白總量而非構象。
研究結論指出，iMFI通過整合轉染廣度（陽性細胞%）和深度（表達水平）成為更全面的功能指標。LC-MS作為無抗體替代方案，不僅與流式結果高度吻合，更具平臺化優勢——新抗原僅需通過計算機模擬篩選特異性肽段即可建立檢測方法。值得注意的是，對于降解樣本或異質mRNA比例的疫苗，劑量反應曲線會喪失平行性，使得現行藥典推薦的相對效價測定法適用性受限。作者建議參考基因治療產品指導原則，采用分步評估策略：分別檢測LNP遞送效率（轉染率）和mRNA翻譯能力（如無細胞表達系統），從而更精準反映mRNA疫苗的復雜作用機制。
這項研究為mRNA疫苗質量控制提供了重要方法論創新：iMFI指標解決了傳統轉染效率檢測的靈敏度不足問題，而LC-MS技術突破了抗體依賴的瓶頸，為快速開發多價疫苗、個性化腫瘤疫苗等新興產品的功能評估奠定了技術基礎。隨著mRNA技術向傳染病預防、腫瘤免疫等領域的拓展，這種可量化、可標準化的評估平臺將顯著加速相關產品的研發進程。
