在生命的長河中，造血系統如同一個永不枯竭的源泉，持續(xù)為機體提供各類血細胞。這個復雜過程的核心是造血干細胞（HSC），它們擁有自我更新和多向分化的雙重能力，精準地平衡著自我復制與分化，以維持終身的造血穩(wěn)態(tài)。然而，這個精密平衡是如何被調控的，尤其是決定細胞命運的“開關”分子——轉錄因子（TF）——其蛋白水平的精確控制機制，仍是領域內亟待解決的關鍵科學問題。

近年來，RNA修飾，即“表觀轉錄組學”，作為基因表達調控的新前沿，逐漸嶄露頭角。其中，N6-甲基腺苷（m⁶A）的研究較為深入，其在造血中的作用已被廣泛報道。然而，另一種重要的RNA修飾——N4-乙酰胞苷（ac4C），其催化酶為N-乙酰轉移酶10（NAT10），在正常造血過程中的功能卻鮮為人知。此前的研究多聚焦于ac4C在惡性腫瘤（如白血病）中的作用，但它在生理狀態(tài)下，尤其是在稀缺且功能關鍵的造血干細胞/祖細胞（HSPC）群體中，究竟扮演什么角色，仍然是一個未解的謎團。探索ac4C在正常造血中的作用，不僅有助于完善基因表達調控的網絡，也可能為理解造血發(fā)育異常及相關疾病提供新的線索。

為了回答這些問題，一項發(fā)表在《SCIENCE ADVANCES》上的研究應運而生。研究人員開發(fā)了一種名為超低輸入乙酰化RNA免疫共沉淀測序（ULAC-seq）的新技術，成功繪制了小鼠不同HSPC亞群中ac4C的動態(tài)修飾圖譜，并深入探究了其催化酶Nat10在造血干細胞維持和分化中的關鍵作用及分子機制。

為開展本研究，研究人員主要運用了以下幾項關鍵技術：首先，他們開發(fā)了ULAC-seq技術，用于在納克級RNA輸入量下高靈敏度地繪制稀有HSPC亞群中的ac4C修飾圖譜；其次，利用條件性基因敲除小鼠模型（Mx1-cre; Nat10^fl/fl和 Vav-cre; Nat10^fl/fl）在體和離體研究Nat10的功能；第三，通過流式細胞術分選、體外集落形成實驗、競爭性重建實驗等評估HSC功能；第四，結合蛋白質組學（Orbitrap Astral質譜）和轉錄組學（RNA-seq, scRNA-seq）多組學分析，尋找Nat10的關鍵靶點；最后，通過救援實驗驗證關鍵靶點基因（如Nfix）的功能。

研究人員首先通過RNA測序（RNA-seq）發(fā)現，與成熟血細胞相比，HSPC中RNA/mRNA修飾相關通路顯著富集，其中ac4C的寫入酶Nat10表達上調，提示其潛在作用。為了解析ac4C在稀有HSPC中的分布，他們開發(fā)了ULAC-seq技術。應用該技術對分選的6種小鼠BM HSPC亞群進行ac4C測序，揭示了ac4C修飾具有高度動態(tài)性和細胞類型特異性。值得注意的是，紅系-巨核系祖細胞（MEP）中的ac4C水平和峰值數量最高，這與Nat10在MEP中表達最高相一致。功能分析顯示，細胞類型特異的ac4C峰相關基因富集于與該細胞類型功能相關的通路中。這些結果表明，Nat10介導的ac4C修飾可能參與造血過程中細胞身份的建立。

為了探究ac4C是否在體內調控造血，研究人員構建了誘導型條件性敲除小鼠模型（Mx1-cre; Nat10^fl/fl，簡稱Nat10-cKO）。成年小鼠注射pIpC誘導Nat10缺失后，外周血白細胞、血小板、紅細胞計數以及BM細胞總數均顯著降低，表明Nat10對正常造血至關重要。進一步流式分析發(fā)現，Nat10缺失導致長期HSC（LT-HSC）和短期HSC（ST-HSC）的頻率和絕對數量顯著減少，而多能祖細胞2（MPP2）增加，同時淋系祖細胞（CLP）、髓系祖細胞（CMP）及其下游成熟細胞減少，但MEP卻異常積累。單細胞RNA測序（scRNA-seq）結果與流式分析一致，確認了Nat10-cKO小鼠中LT-HSC和ST-HSC減少而MEP增加。這些發(fā)現表明Nat10缺失破壞了HSC池穩(wěn)態(tài)，并可能阻斷了MEP的分化。

為了研究Nat10在胚胎造血中的作用，研究人員構建了Vav-cre; Nat10^fl/fl（vcNat10^-/-）小鼠模型。他們發(fā)現vcNat10^-/-會導致胚胎致死。在胚胎期第13.5-14.5天（E13.5-E14.5），vcNat10^-/-胚胎的肝臟變小、呈現貧血跡象，肝臟細胞總數和LK細胞頻率及數量均顯著減少，其胎肝細胞的體外集落形成能力也嚴重受損。這表明Nat10在胚胎期HSC維持中同樣發(fā)揮關鍵作用。

機制探索發(fā)現，Nat10缺失的HSC更多地退出G₀期（靜止期）進入細胞周期，且凋亡增加，提示HSC池過早耗竭。體外集落形成實驗表明，Nat10缺失的HSPC形成集落的數量、大小以及CD11b⁺細胞比例均顯著降低。重要的是，回補野生型NAT10能挽救Nat10缺失導致的集落形成和分化缺陷，而其催化死亡突變體（G641E）或解旋酶結構域缺失突變體（Δhelicase）則不能，說明Nat10的ac4C寫入酶活性是其功能所必需的。競爭性重建實驗進一步證實，無論是先敲除后移植還是先移植后誘導敲除，Nat10缺失都會導致供體來源細胞在初級和次級移植受體中的嵌合水平顯著降低，證明Nat10是HSC維持和長期重建能力的細胞內在調控因子。

對MEP下游譜系的細致分析發(fā)現，盡管MEP積累，但巨核系祖細胞（MkP）、巨核細胞（Mk）以及紅系分化各個階段的細胞（proE, EryA, EryB, EryC）在Nat10-cKO小鼠BM中均顯著減少。分選的Nat10缺失MEP在體外難以形成集落。scRNA-seq顯示，Nat10缺失的MEP中下調的基因富集于紅細胞分化和發(fā)育相關通路。這些結果綜合表明，Nat10缺失導致HSC穩(wěn)態(tài)紊亂，其特征是HSC池減少、分化偏向MPP2-MEP路徑，但MEP向終末分化受阻，從而異常積累并導致下游紅系和巨核系細胞缺失。

通過ULAC-seq比較WT和Nat10-cKO小鼠Lin^-HSPC的ac4C譜，發(fā)現Nat10缺失導致ac4C全局性降低，并鑒定出3118個可靠的低乙酰化峰，其中大部分（81.72%）具有細胞類型特異性。許多關鍵造血TF（如Nfix, Lcor, Erg, Smad2）的ac4C水平在Nat10缺失后顯著下調。整合ac4C譜和基因表達數據發(fā)現，ac4C水平變化與基因mRNA表達變化無相關性，提示ac4C可能影響mRNA翻譯而非穩(wěn)定性。隨后，研究人員對少量（3000個）WT和Nat10缺失HSC進行了高靈敏度蛋白質組學分析。結果顯示，ac4C修飾的mRNA所編碼的蛋白質在Nat10缺失后其水平降低更顯著。他們聚焦于136個既是ac4C修飾目標又在Nat10缺失后蛋白水平下降的基因，這些基因功能富集于細胞靜止、巨核細胞發(fā)育、翻譯、干細胞群體維持等通路。在HSC相關TF中，Nfix、Kit和Tal1在Nat10缺失后蛋白水平下降而mRNA水平不變，被確定為候選靶點。

Nfix因其在HSC維持和MEP分化中的已知作用而被選為重點研究對象。IGV可視化及ULAC-qPCR證實Nfix mRNA在HSC中ac4C修飾水平最高，且該修飾在Nat10缺失后顯著降低。蛋白質印跡驗證了Nfix和Kit蛋白水平在Nat10缺失的Lin^-HSPC中下降。功能上，回補Nfix能顯著挽救Nat10缺失HSPC的集落形成缺陷和在體重建能力缺陷，效果優(yōu)于回補Kit，表明Nfix是Nat10的關鍵下游效應分子。進一步分析發(fā)現，Nfix的靶基因（如Mpl, Irf8, Itga2b）在Nat10缺失的HSPC中表達下調。RNA免疫共沉淀（RIP）實驗表明，Nat10敲低會抑制Eif3復合物與Nfix mRNA的結合，提示Nat10介導的ac4C通過招募Eif3來增強靶mRNA的翻譯。

本研究確立了Nat10通過催化ac4C修飾關鍵轉錄因子（如Nfix）的mRNA，進而增強其翻譯效率（而非影響mRNA穩(wěn)定性），從而在轉錄后水平精確調控蛋白質豐度，最終協調HSC命運決定的新機制。這一“表觀轉錄組-轉錄組”調控軸的發(fā)現，深化了對正常造血穩(wěn)態(tài)維持的理解，將RNA修飾與轉錄調控網絡緊密聯系起來。研究所開發(fā)的ULAC-seq技術為在稀有細胞群體中研究ac4C及其他RNA修飾提供了有力工具。值得注意的是，生理水平的Nat10對造血至關重要，而其部分抑制可能被耐受，這為靶向NAT10治療其依賴的惡性腫瘤（如白血病）而不嚴重損害正常造血提供了潛在的治療窗口。總之，該研究揭示了ac4C在正常造血中的核心作用，為探索造血發(fā)育異常及相關疾病的病理機制和潛在治療策略提供了新的理論基礎和視角。