肌肉細胞中縱橫交錯的T小管（Transverse tubules, T-tubules）網絡是 excitation-contraction coupling（興奮-收縮偶聯）的核心結構，確保動作電位快速同步傳遞至肌質網，觸發鈣離子釋放與肌肉收縮。然而，T小管形成的分子機制長期以來籠罩在迷霧之中。尤其令人困惑的是，與T小管缺陷相關的先天性肌�。ㄈ缰醒牒思〔。┑闹虏』�因（如BIN1/Amph2、DNM2、MTM1）雖已被鑒定，但其如何精確調控膜形態建成的早期事件仍不清楚。此外，在脊椎動物中，小窩蛋白Caveolin-3（Cav3）被報道參與T小管形成的起始，但進化上更早出現T小管的無脊椎動物（如果蠅）卻完全缺失Cav3基因，暗示存在一條獨立且古老的T小管生物發生途徑。

為了揭開這一謎題，發表在《SCIENCE ADVANCES》上的這項研究，獨辟蹊徑地利用果蠅幼蟲體壁�。˙ody Wall Muscles, BWMs）這一理想模型，結合前沿的鄰近標記蛋白質組學（proximity labeling proteomics）和體內RNAi篩選，意外地發現線性泛素鏈組裝復合物（Linear ubiquitin chain assembly complex, LUBAC）的催化亞基——E3泛素連接酶LUBEL（果蠅中為HOIP的同源物，在哺乳動物中稱為RNF31），是T小管正常形態建成不可或缺的關鍵調控因子。

研究人員首先構建了與工程化生物素連接酶miniTurbo（mnTb）融合的Amph（Amph-mnTb）轉基因果蠅，通過喂食生物素，在體內對T小管及其鄰近蛋白質進行特異性標記，隨后通過質譜分析，建立了Amph的鄰近蛋白質組圖譜。從這份包含249個候選基因的名單出發，他們進行了肌肉特異性RNAi篩選，結果發現，靶向LUBEL的三個獨立RNAi品系均導致最嚴重的T小管缺陷，表型與Amph敲低相似，提示LUBEL在T小管形成中扮演著關鍵角色。

為了驗證篩選結果，研究者分析了LUBEL的基因突變體。結果發現，無論是導致C端區域（包含RBR結構域）缺失的LUBEL^MI突變體，還是酶活喪失的LUBEL^DelR2（RBR結構域C端截短）和LUBEL^CC/SS（關鍵半胱氨酸突變）突變體，其肌肉細胞中的T小管均出現嚴重異常，由正常的管狀網絡轉變為片狀結構。更重要的是，在野生型果蠅肌肉中過表達特異性水解M1-linked泛素鏈的去泛素化酶OTULIN，也能模擬LUBEL功能缺失的表型，確證了LUBEL的E3連接酶活性及其催化的M1-linked泛素化對于T小管形態至關重要。值得注意的是，NF-κB信號通路的關鍵組分Rel（果蠅NF-κB）和Kenny（果蠅NEMO/IKKγ）的缺失突變體并未出現T小管缺陷，表明LUBEL在此過程中的功能獨立于其經典的NF-κB信號調控角色。

那么，LUBEL是如何影響T小管的呢？初步排除了影響Amph蛋白表達水平的可能性后，免疫熒光染色顯示，在LUBEL突變體中，Amph依然與T小管標記物Discs large 1（Dlg1）共定位於膜結構上，但膜的形態發生了根本性改變。透射電子顯微鏡（Transmission Electron Microscopy, TEM）和聚焦離子束掃描電子顯微鏡（Focused Ion Beam-Scanning Electron Microscopy, FIB-SEM）的三維重構結果更為直觀地揭示了這種改變：野生型肌肉中可見清晰的T小管圓形截面，而LUBEL突變體中則充斥著拉長的管狀或扁平片狀膜結構，失去了正常的管網形態。

接下來的研究聚焦于LUBEL與Amph之間的功能性相互作用。通過免疫共沉淀-質譜（Co-immunoprecipitation-mass spectrometry, IP-MS）和基于mnTb-LUBEL的鄰近標記蛋白質組學分析，均將Amph鑒定為LUBEL的高置信度相互作用蛋白。精細的域映射和點突變實驗表明，LUBEL N端區域（1-872）內的一個富含脯氨酸的基序（152-157位氨基酸，尤其是Arg¹⁵⁷）與Amph的SH3結構域直接結合。AlphaFold2結構預測顯示，LUBEL的Arg¹⁵⁷深埋在Amph SH3結構域的一個酸性口袋中，形成鹽橋和氫鍵。功能挽救實驗證實，能夠與Amph正常結合的全長LUBEL可以拯救LUBEL突變體的T小管缺陷，而無法結合Amph的LUBEL^R157A點突變體則完全喪失挽救能力，凸顯了LUBEL-Amph直接相互作用在T小管形成中的核心地位。

活細胞成像顯示，mNeonGreen（mNG）標記的LUBEL并非均勻分布，而是在T小管上形成點狀結構（puncta），這些點狀結構與Amph及M1-linked泛素鏈共定位。熒光漂白恢復（Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP）分析表明LUBEL puncta具有極低的流動性。通過GeneSwitch（GS）系統時序性控制mNG-LUBEL在LUBEL突變體中的表達，研究者觀察到，在誘導表達18-24小時后，LUBEL puncta出現在正在形成的T小管前體結構的邊緣，隨后Dlg1陽性的片狀結構逐漸向管狀網絡轉變，48小時后幾乎完全恢復正常。這表明LUBEL puncta在T小管生物發生的早期階段發揮作用。

LUBEL puncta的形成機制涉及多價相互作用。研究發現LUBEL可通過其固有的無序區（Intrinsically Disordered Region, IDR）發生同源相互作用，并且能夠發生自身泛素化（主要發生在Lys²²⁴和Lys²⁴⁶¹位點）。其UBA2結構域對M1-linked泛素鏈具有親和力，可能進一步鞏固了puncta的穩定性。功能實驗表明，缺失UBA2結構域或預測為排斥性的IDR3區域，都會導致LUBEL喪失挽救T小管缺陷的能力。在HeLa細胞中進行的半重建實驗進一步支持了這一模型：穩定表達果蠅Amph-GFP的HeLa細胞本身膜形態正常，但共轉染LUBEL后，可誘導形成Amph和M1-linked泛素鏈共定位的復雜膜結構，電鏡觀察也證實了不規則膜結構的出現。

最后，進化分析揭示了這一機制的古老起源和可能的物種特異性。生物信息學預測和Fluoppi相互作用實驗表明，RNF31（LUBEL/HOIP）與Amph的相互作用在棘皮動物（海星）、腕足動物（海豆芽）、刺胞動物（星狀海葵）等無脊椎動物中保守，但在脊椎動物和頭索動物（文昌魚）中，由于RNF31的脯氨酸富集基序丟失，該相互作用消失。有趣的是，這種相互作用的丟失與 caveolin-forming caveolins（Cav1/3）在脊椎動物/脊索動物中的出現時間點相吻合。在斑馬魚中敲低RNF31并不影響T小管形態，而Cav3在其肌肉中明確表達，提示在脊椎動物中，Cav3可能取代了RNF31在T小管起始形成中的功能。

綜上所述，本研究首次揭示了線性泛素化在膜變形中的非經典功能。研究者提出了一個模型：Amph通過其兩性螺旋初始錨定于膜上，隨后通過其SH3結構域招募LUBEL。LUBEL通過其IDR1的同源相互作用、自身泛素化以及UBA2結構域與M1-linked泛素鏈的結合，形成多價相互作用網絡，在膜上組裝成穩定的puncta。這些puncta一方面可能通過局部濃縮Amph分子，促進其BAR結構域形成寡聚化支架，驅動膜管化；另一方面，puncta內排斥性IDR3產生的空間位阻也可能誘導膜產生正向彎曲，協同促進T小管的延伸。這項工作不僅闡明了T小管生物發生的一條新通路，拓寬了對泛素化系統在細胞器形態建成中作用的認識，還從進化角度揭示了膜變形機制的可塑性，為理解相關肌肉疾病的病理機制提供了新的視角。

本研究綜合利用了果蠅遺傳學、體內鄰近標記蛋白質組學（Amph-mnTb）、肌肉特異性RNAi篩選、免疫熒光染色、免疫印跡、免疫共沉淀-質譜（IP-MS）、透射電鏡（TEM）、聚焦離子束掃描電子顯微鏡（FIB-SEM）三維重構、熒光漂白恢復（FRAP）、HeLa細胞模型、AlphaFold2/3結構預測以及跨物種進化分析（包括斑馬魚基因敲低和Fluoppi相互作用驗證）等多種技術手段，系統深入地揭示了LUBEL介導的線性泛素化在T小管形成中的作用機制。

通過Amph-mnTb介導的體內鄰近標記和質譜分析，獲得了T小管區域的蛋白質組圖譜。隨后的RNAi篩選發現，敲低E3連接酶LUBEL導致嚴重的T小管形態缺陷，類似于Amph敲低的表現。

LUBEL基因突變體（酶活喪失）以及過表達M1-linked泛素鏈特異性水解酶OTULIN，均導致T小管由管狀網絡變為片狀結構，證明其功能依賴于催化M1-linked泛素鏈的形成，且該過程不依賴于NF-κB信號通路。

LUBEL缺失不影響Amph的蛋白水平和膜定位，但電鏡和FIB-SEM三維重構顯示，突變體中T小管相關膜結構失去管狀特征，呈現片狀形態。

蛋白質相互作用篩選和點突變實驗證實LUBEL與Amph直接結合，該相互作用對于LUBEL定位至膜并執行其促進T小管形成的功能是必需的。

活細胞成像顯示LUBEL在T小管上形成點狀結構，與Amph和M1-linked泛素鏈共定位。FRAP表明這些點狀結構流動性低。時序性表達實驗顯示LUBEL點狀結構出現在T小管形成的早期。

LUBEL可通過其IDR發生同源相互作用并進行自身泛素化，其UBA2結構域和IDR3對其功能至關重要。在HeLa細胞中，LUBEL表達能增強Amph介導的膜變形。

進化分析表明RNF31-Amph相互作用在多數無脊椎動物中存在，但在脊椎動物中丟失，其功能可能被 caveolin-forming caveolins（Cav3）所替代，斑馬魚實驗支持這一觀點。

本研究發現線性泛素化是調控T小管生物發生的關鍵信號。LUBEL/RNF31通過直接與Amph相互作用，在膜上形成富含M1-linked泛素鏈的點狀結構，這些結構通過多價相互作用和可能的分子擁擠效應，促進Amph介導的膜管化。該機制在進化上古老，但在脊椎動物中被 caveolin-dependent 機制所替代。這項研究揭示了泛素化在細胞器形態建成中的新功能，為理解肌肉疾病提供了新的分子框架，并提示BAR結構域蛋白的功能可能普遍受到E3連接酶及其催化的特定泛素化類型的調控。