在免疫系統(tǒng)的精密防御網(wǎng)絡(luò)中，T細(xì)胞扮演著核心角色。傳統(tǒng)上，CD8⁺T細(xì)胞被認(rèn)為是主要的“殺手”細(xì)胞，負(fù)責(zé)清除受感染的細(xì)胞或癌細(xì)胞。然而，另一類不那么為人所知的“殺手”——CD4⁺細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CD4-CTLs），雖然早在幾十年前就被發(fā)現(xiàn)存在于多種感染性疾病、癌癥和自身免疫病中，但其起源、發(fā)育路徑和功能潛力始終籠罩在迷霧之中。與CD8-CTLs相比，CD4-CTLs的研究相對(duì)滯后，這限制了其在疫苗設(shè)計(jì)、免疫治療等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力。一個(gè)核心的科學(xué)問(wèn)題是：CD4⁺T細(xì)胞，通常以“輔助”功能著稱，是如何獲得強(qiáng)大的細(xì)胞毒性能力的？它們的“記憶”是如何形成和維持的？是否存在一個(gè)長(zhǎng)期的“干細(xì)胞樣”記憶庫(kù)，能夠快速響應(yīng)威脅，分化為效應(yīng)細(xì)胞？解答這些問(wèn)題，對(duì)于理解適應(yīng)性免疫的全面性以及開發(fā)新的治療策略至關(guān)重要。發(fā)表在《SCIENCE ADVANCES》上的這項(xiàng)研究，正是為了撥開這重重迷霧。

研究人員綜合運(yùn)用了流式細(xì)胞術(shù)、體外T細(xì)胞極化培養(yǎng)模型、RNA測(cè)序（RNA-seq）、T細(xì)胞受體測(cè)序（TCR-seq）、 assay for transposase-accessible chromatin using sequencing（ATAC-seq，用于分析染色質(zhì)開放性）、單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和單細(xì)胞ATAC測(cè)序（scATAC-seq）等多種技術(shù)手段。研究樣本來(lái)源于健康捐贈(zèng)者的外周血單核細(xì)胞（PBMCs）。

通過(guò)對(duì)來(lái)自相同供體的CD4-CTLs（主要富集于CD4-T_EMRA效應(yīng)記憶亞群）和CD8-CTLs（CD8-T_EMRA）進(jìn)行平行分析，轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)表達(dá)水平（如GZMB, PRF1, GNLY, CX3CR1, GPR56等）的比較表明，兩者在細(xì)胞毒性相關(guān)基因的表達(dá)上高度相似，主成分分析（PCA）中聚集在一起，基因集富集分析（GSEA）也未顯示顯著差異。TCR repertoire分析進(jìn)一步揭示，兩者均呈現(xiàn)高度的克隆擴(kuò)增，表明它們都是抗原驅(qū)動(dòng)的效應(yīng)細(xì)胞。這些結(jié)果表明，CD4-CTLs擁有與經(jīng)典CD8-CTLs相媲美的細(xì)胞毒性潛力。

為了追溯CD4-CTLs的發(fā)育譜系，研究人員深入分析了CD4⁺T細(xì)胞的各個(gè)記憶亞群（T_N, T_SCM, T_CM, T_EM, T_EMRA-P, T_EMRA-E）的轉(zhuǎn)錄組和染色質(zhì)開放性（ATAC-seq）。研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞記憶T細(xì)胞（T_SCM）同時(shí)高表達(dá)與長(zhǎng)期存活/干細(xì)胞特性相關(guān)的基因（如TCF7, CD27）和細(xì)胞毒性效應(yīng)基因（如GZMB, PRF1），表現(xiàn)出獨(dú)特的“雙重特征”。TCR克隆型共享分析顯示，效應(yīng)性CD4-T_EMRA-E中擴(kuò)增的克隆型在T_SCM亞群中有顯著共享，提示T_SCM可能是CD4-CTLs的前體細(xì)胞。

通過(guò)scRNA-seq和scATAC-seq對(duì)T_SCM細(xì)胞進(jìn)行高分辨率解析，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)部存在高度異質(zhì)性。其中，兩個(gè)特定的細(xì)胞簇（簇11和12）特異性地高表達(dá)細(xì)胞毒性分子（GZMB, GNLY, PRF1）和關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（如TBX21, ZEB2, ZNF683），被定義為T_SCM-CTL細(xì)胞。scATAC-seq分析顯示，這些細(xì)胞的染色質(zhì)在細(xì)胞毒性基因的調(diào)控區(qū)域和基因體區(qū)域呈現(xiàn)更高的開放性，并且富集了T-bet、EOMES等細(xì)胞毒性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合 motif，表明其表觀遺傳狀態(tài)已為細(xì)胞毒性程序的啟動(dòng)做好了準(zhǔn)備。此外，這些T_SCM-CTL細(xì)胞共表達(dá)TOX和PD1，類似于CD8⁺T細(xì)胞中描述的干細(xì)胞樣前體細(xì)胞。

整合scRNA-seq和配對(duì)scTCR-seq數(shù)據(jù)分析T_SCM和T_EMRA細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)T_SCM-CTL細(xì)胞（對(duì)應(yīng)于整合數(shù)據(jù)中的簇13和14）與CD4-T_EMRA效應(yīng)細(xì)胞共享大量TCR克隆型。這些共享的克隆型在T_SCM中頻率很低，但在T_EMRA中高度擴(kuò)增，提供了強(qiáng)有力的證據(jù)，表明T_SCM-CTL是CD4-CTL效應(yīng)細(xì)胞在體內(nèi)的直接前體。

研究人員建立了一個(gè)體外分化模型，通過(guò)在T_H1極化條件（IL-12, IFN-γ, 抗IL-4/IL-17抗體）下反復(fù)刺激純真的CD4⁺T_N細(xì)胞，成功誘導(dǎo)其表達(dá)細(xì)胞毒性分子（GZMB, PRF1, GNLY），并具備殺傷靶細(xì)胞的能力。scRNA-seq追蹤分化過(guò)程顯示，細(xì)胞經(jīng)歷了從純真狀態(tài)到效應(yīng)狀態(tài)的轉(zhuǎn)變，并鑒定出具有不同細(xì)胞毒性水平的中間群體。scATAC-seq分析進(jìn)一步揭示了伴隨分化過(guò)程，細(xì)胞毒性基因位點(diǎn)的染色質(zhì)開放性逐漸增加，重現(xiàn)了體內(nèi)T_SCM-CTL到T_EMRA-E的表觀遺傳變化軌跡。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明，以T_SCM細(xì)胞為起始群體進(jìn)行T_H1極化，比從T_N細(xì)胞開始，能更快速地獲得高表達(dá)細(xì)胞毒性分子的效應(yīng)細(xì)胞，并且克隆擴(kuò)增更為顯著。這進(jìn)一步支持了T_SCM，特別是其中的T_SCM-CTL亞群，是更接近效應(yīng)階段的CD4-CTL前體。

本研究系統(tǒng)性地闡明了人類CD4-CTLs的發(fā)育譜系，首次鑒定出存在于CD4⁺T_SCM記憶庫(kù)中的、預(yù)先決定向細(xì)胞毒性命運(yùn)分化的T_SCM-CTL亞群。研究證實(shí)CD4-CTLs在分子水平上與CD8-CTLs同樣強(qiáng)大，破除了對(duì)其細(xì)胞毒性潛能的質(zhì)疑。通過(guò)體外分化模型，研究不僅驗(yàn)證了從T_N經(jīng)T_SCM-CTL到效應(yīng)細(xì)胞的線性發(fā)育路徑，還揭示了其背后動(dòng)態(tài)的表觀遺傳重編程過(guò)程。

這項(xiàng)研究的發(fā)現(xiàn)具有多重重要意義：首先，它深化了對(duì)CD4⁺T細(xì)胞功能多樣性和記憶形成的理解。其次，它表明在疫苗設(shè)計(jì)和評(píng)估中，應(yīng)同時(shí)關(guān)注CD4-CTLs和CD8-CTLs的反應(yīng)，這可能為針對(duì)某些免疫逃逸策略的病原體提供更有效的保護(hù)。再者，鑒定出的T_SCM-CTL亞群及其關(guān)鍵調(diào)控因子，為開發(fā)基于CD4-CTLs的過(guò)繼性細(xì)胞療法（如用于癌癥治療）提供了新的細(xì)胞來(lái)源和靶點(diǎn)。最后，建立的體外高效生成具有長(zhǎng)期存活潛力的CD4-CTLs的方法，為將其轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用鋪平了道路。總之，該研究為探索CD4-CTLs在感染性疾病、癌癥和自身免疫病等多種疾病中的治療潛力奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。