《SCIENCE ADVANCES》：Mouse digit AAV gene delivery into fibroblasts regulates regenerative outcome
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本研究通過單細胞RNA測序（scRNA-seq）對比分析小鼠再生性（P3）與非再生性（P2）指端截肢模型，鑒定出與纖維化和再生相關的成纖維細胞亞群及關鍵基因（如Pcolce2、Prelp、Ccl2、Mest），并開發了腺相關病毒（AAV）介導的局部基因遞送技術，證明靶向調控成纖維細胞基因表達可改變骨骼再生形態與修復程度，為哺乳動物組織再生機制研究提供了新策略。
摘要
小鼠遠端指端（P3）截肢后能自發再生，而近端指端（P2）則發生纖維化。本研究通過對比P2纖維化與P3再生過程中的單細胞RNA測序（scRNA-seq）數據，計算鑒定出與纖維化和再生相關的成纖維細胞亞群及候選基因。為驗證這些基因的功能，研究團隊開發了一種高效的AAV介導的基因遞送技術，靶向感染指端成纖維細胞。實驗發現，在再生芽基中過表達促纖維化基因Pcolce2或Prelp會改變正常再生骨骼的三維形態，而在P2指端過表達促再生因子Ccl2或Mest則顯著促進骨沉積。這些結果證實，計算生物學分析與AAV遞送技術相結合，為揭示哺乳動物指端纖維化與再生的驅動因素提供了有力框架。
引言
小鼠指端是研究哺乳動物復合組織再生的理想模型。遠端指骨（P3）截肢后能形成再生芽基并在28天內完全再生，而近端指骨（P2）截肢則導致纖維化愈合。既往研究提示P2與P3成纖維細胞存在先天差異，但缺乏對細胞亞群特異性基因功能的分析。本研究通過scRNA-seq時間序列數據直接比較P2纖維化與P3再生過程中的成纖維細胞異質性，并利用AAV技術進行基因功能驗證，旨在篩選決定再生與纖維化結局的關鍵因子。
結果
P2纖維化與P3再生中的成纖維細胞亞群異質性
scRNA-seq分析顯示，P2纖維化過程中成纖維細胞比例顯著增加，且存在19個亞群，其中8個亞群在纖維化不同階段呈現動態變化。通過整合P2與P3數據，發現即使處于穩態，兩者成纖維細胞亞群比例也存在顯著差異。空間轉錄組驗證（如Pi16、Anxa8表達）進一步證實P2與P3成纖維細胞具有區域特異性分布。基因本體（GO）富集分析表明，P3富集亞群多與骨發育和免疫應答相關，而P2富集亞群則涉及GTP酶信號和細胞黏附。最終篩選出98個候選促纖維化基因和27個候選促再生基因。
AAV2/6介導的成纖維細胞基因遞送
通過比較多種AAV偽型（6、7m8、8、9、PHP.S），發現AAV6在指端成纖維細胞中感染效率最高，且感染后3–10天表達達峰。免疫組化證實AAV6主要感染Vimentin+間充質細胞，且不影響正常再生或修復過程。
促纖維化基因過表達改變P3再生形態
在P3再生芽基中過表達Pcolce2導致再生骨骼沿近遠軸（P-D）長度增加但前后軸（A-P）寬度變薄，而過表達Prelp則使骨骼變短增厚，提示二者通過調控細胞外基質（ECM）影響骨骼形態。Ccn3過表達未引起顯著表型變化。
促再生基因誘導P2骨修復
在P2指端過表達Ccl2或Mest可顯著增加新骨面積和長度，其中Mest誘導的骨再生效果尤為明顯，伴隨遠端結締組織聚集和SP7+成骨細胞增多。相反，Cxcl2過表達抑制骨修復，可能與中性粒細胞過度招募有關。
討論
本研究首次通過scRNA-seq直接對比P2纖維化與P3再生的成纖維細胞動態，并建立AAV介導的基因功能篩選平臺。發現Pcolce2、Prelp等ECM相關基因調控骨骼形態，而Ccl2、Mest等免疫調節基因促進再生，為理解組織修復結局提供了新視角。未來可結合多基因共表達或早期干預策略進一步優化再生效果。
材料與方法
實驗使用野生型FVB/NJ小鼠，截肢后6天局部注射高滴度AAV（>1×1013vg/ml）。scRNA-seq數據通過Seurat軟件分析，基因過表達通過qPCR驗證，骨骼形態采用微CT（microCT）和熒光雙標（鈣黃綠素/阿爾新紅）量化。統計方法包括ANOVA、MANOVA等，顯著性閾值設為P<0.05。
