《Breast Cancer: Targets and Therapy》：The Novel ROCK Inhibitor Fasudil Derivative Fasudil-D-6h Prevents Tumour Progression by Regulating the Adherens Junction Signalling Pathway in Triple-Negative Breast Cancer
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本文推薦了一種新型ROCK抑制劑Fasudil-D-6h，其通過獨特地調控黏附連接（AJ）信號通路，顯著抑制三陰性乳腺癌（TNBC）細胞增殖、誘導凋亡并恢復上皮完整性。研究結合轉錄組學與體內外實驗，證實該衍生物能有效下調ROCK1/2，上調CDC42、ZO-1等關鍵蛋白，展現優于母體化合物Fasudil的療效與臨床轉化潛力。
Fasudil-D-6h抑制TNBC細胞增殖并促進其凋亡
為了闡明新型ROCK抑制劑Fasudil-D-6h對三陰性乳腺癌（TNBC）細胞的影響，研究首先在MDA-MB-231細胞中檢測了該化合物對ROCK1和ROCK2 mRNA表達水平的作用。qRT-PCR結果顯示，與未處理（0 μM）的陰性對照組相比，使用5 μM或10 μM濃度的Fasudil-D-6h或陽性對照藥HA-1100（10 μM）處理24小時后，MDA-MB-231細胞中ROCK1和ROCK2的mRNA水平均顯著降低。這表明Fasudil-D-6h能夠有效抑制TNBC細胞中ROCK1/2的表達。
進一步的功能實驗揭示了Fasudil-D-6h的強大抗腫瘤活性。CCK-8細胞增殖實驗表明，在處理96小時后，5 μM和10 μM的Fasudil-D-6h或10 μM的HA-1100均能顯著抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞的增殖。值得注意的是，在相同濃度（10 μM）下，Fasudil-D-6h對細胞增殖的抑制效果強于HA-1100。流式細胞術檢測細胞凋亡的結果進一步驗證了其促凋亡作用。在MCF-7和MDA-MB-231細胞中，10 μM Fasudil-D-6h處理組相較于5 μM處理組，早期和晚期凋亡細胞比例均顯著增加。綜上所述，Fasudil-D-6h能夠下調ROCK1/ROCK2的表達，抑制TNBC細胞增殖并促進其凋亡。
黏附連接和乳腺癌信號通路參與Fasudil-D-6h對MDA-MB-231細胞的作用機制
為了深入探索Fasudil-D-6h的作用機制，研究對經10 μM Fasudil-D-6h處理的MDA-MB-231細胞進行了轉錄組測序。通過差異表達分析，共鑒定出8092個差異表達基因（DEGs），其中4123個基因上調，3969個基因下調。
對這些DEGs進行基因本體（GO）富集分析發現，它們在細胞組分（CC）域中顯著富集于“細胞-基質黏附連接”；在生物過程（BP）域中顯著富集于“Wnt信號通路正調控”、“DNA損傷反應的內在凋亡信號通路”；在分子功能（MF）域中顯著富集于“含基團的轉移酶活性”、“嘌呤核糖核苷酸結合”。更重要的是，京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析顯示，所有DEGs在“黏附連接”和“乳腺癌信號通路”中顯著富集。這一無偏倚的轉錄組學分析提示，黏附連接通路是Fasudil-D-6h作用的關鍵靶點。
Fasudil-D-6h上調MDA-MB-231細胞中黏附連接信號通路相關基因的表達
基于轉錄組學結果，研究構建了ROCK1、ROCK2及差異表達的黏附連接通路相關基因編碼蛋白的蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡。該網絡提示了這些基因之間可能存在新的相互作用關系，為理解Fasudil-D-6h的復雜作用機制提供了線索。
研究進一步通過qRT-PCR和Western blotting在分子和蛋白水平上驗證了Fasudil-D-6h對黏附連接通路關鍵組分的影響。qRT-PCR結果顯示，與未處理組相比，經5 μM或10 μM Fasudil-D-6h或HA-1100處理的MDA-MB-231細胞中，Cdc42、Rac3、Src、ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA表達水平均顯著升高。Western blotting結果與之高度一致，CDC42、RAC3、SRC、ZO-1、Occludin和Claudin-1的蛋白表達水平在Fasudil-D-6h處理組也呈現劑量依賴性的顯著上調。這些結果強有力地證實，Fasudil-D-6h能夠通過抑制ROCK活性，顯著上調TNBC細胞中與黏附連接和緊密連接完整性密切相關的關鍵基因的表達。
Fasudil-D-6h抑制裸鼠皮下乳腺癌腫瘤的生長
為了評估Fasudil-D-6h的體內抗腫瘤效果，研究建立了MDA-MB-231細胞的裸鼠皮下移植瘤模型。當腫瘤長至一定大小后，將荷瘤鼠隨機分為三組：對照組（注射生理鹽水NS）、低劑量組（10 mg/kg Fasudil-D-6h）和高劑量組（20 mg/kg Fasudil-D-6h），每周進行瘤周注射。
觀察發現，與NS對照組相比，10 mg/kg和20 mg/kg Fasudil-D-6h處理組的腫瘤生長均受到顯著抑制。實驗結束時剝離腫瘤并進行稱重和體積測量，結果顯示兩個Fasudil-D-6h治療組的腫瘤質量和平均體積均顯著小于對照組。這表明Fasudil-D-6h在體內也能有效抑制TNBC腫瘤的生長。
Fasudil-D-6h上調裸鼠皮下乳腺癌腫瘤中黏附連接信號通路相關基因的表達
最后，研究在動物模型水平驗證了Fasudil-D-6h對靶通路的作用。qRT-PCR檢測顯示，與正常組織相比，NS對照組腫瘤組織中ROCK1和ROCK2的mRNA水平顯著升高，而Cdc42、Rac3、Src、ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA水平顯著降低。然而，在10 mg/kg和20 mg/kg Fasudil-D-6h治療組的腫瘤組織中，ROCK1/ROCK2的表達被顯著下調，而上述黏附連接相關基因的表達則被顯著上調。Western blotting分析進一步在蛋白水平證實了這一趨勢：Fasudil-D-6h治療能夠顯著逆轉腫瘤組織中CDC42、RAC3、SRC、ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白的低表達狀態。這些體內實驗數據一致表明，Fasudil-D-6h通過調控ROCK及黏附連接通路關鍵分子，發揮其抑制腫瘤生長的作用。
總結與展望
本研究系統論證了新型ROCK抑制劑Fasudil-D-6h對三陰性乳腺癌的顯著抗腫瘤活性。其作用機制獨特，不僅限于抑制細胞增殖和促進凋亡，更重要的在于通過下調ROCK1/2，積極上調CDC42、RAC3、ZO-1、Occludin、Claudin-1等一系列關鍵蛋白的表達，從而恢復被破壞的黏附連接和緊密連接，重塑上皮完整性。這種以“穩定細胞連接”為核心的作用機制，為對抗TNBC的高侵襲性和轉移性提供了新的治療思路。相較于其母體化合物Fasudil（已臨床用于治療腦血管痙攣）和研究常用工具藥Y-27632，Fasudil-D-6h顯示出更強的效力和獨特的機制側重，因其源于已臨床驗證的藥物而具備良好的轉化潛力。未來研究將集中于深入闡明其調控黏附連接通路的精細分子機制，探索其與標準化療的聯合療效，并推進其臨床前和臨床轉化評估，有望為TNBC患者帶來新的希望。
