《Cancer Management and Research》：Methylation and Expression Analysis of POU4F2, HOXA9, RBM46, and TSGA10 Genes in Bladder Cancer Using Methyl-Sensitive Restriction Enzyme PCR (MSRE-PCR)
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本研究通過甲基化敏感限制性內切酶PCR（MSRE-PCR）技術，系統評估了膀胱癌患者尿液和血漿中POU4F2、HOXA9、RBM46和TSGA10四個基因的甲基化狀態及其表達變化。結果顯示，膀胱癌患者尿液cfDNA中這四個基因的啟動子甲基化水平顯著高于健康對照（約2.2至9.0倍，p < 0.0001），其診斷效能優異（AUC = 0.88–0.98）。主成分分析（PCA）衍生的復合甲基化評分進一步提升了鑒別能力（AUC = 0.993）。基因表達分析發現POU4F2和HOXA9表達下調，而RBM46和TSGA10表達上調。這些發現表明，聯合檢測上述基因的甲基化與表達譜，可作為一種高靈敏度、高特異性的非侵入性生物標志物組合，為膀胱癌的早期診斷提供了新途徑。
研究背景
膀胱癌是全球常見的泌尿系統惡性腫瘤，2020年新發病例約57.3萬例，死亡約21.3萬例。約70-75%的新發病例為非肌層浸潤性膀胱癌（NMIBC），其復發率高達70%，進展為肌層浸潤性膀胱癌（MIBC）的風險為10-20%。目前膀胱癌診斷的金標準是膀胱鏡檢查，但其具有侵入性；尿液細胞學檢查特異性高但靈敏度低，尤其對低級別腫瘤。因此，開發非侵入性、高靈敏度的診斷方法至關重要。DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾，在腫瘤發生發展中起關鍵作用，利用尿液中的細胞游離DNA（cfDNA）進行甲基化分析為膀胱癌的無創診斷提供了新思路。
患者與方法
本研究為病例對照研究，共納入22例經病理證實為尿路上皮癌（移行細胞癌）的膀胱癌患者（其中低級別15例，高級別7例）和30名年齡匹配的健康對照。收集所有受試者的晨尿和血漿樣本。使用商業試劑盒提取cfDNA和總RNA。采用甲基化敏感限制性內切酶PCR（MSRE-PCR）技術評估POU4F2、HOXA9、RBM46和TSGA10基因的甲基化狀態，其中POU4F2、RBM46和TSGA10基因使用HhaI酶，HOXA9基因使用HpaII酶。基因表達水平通過實時熒光定量PCR（Real-Time PCR）進行檢測。使用GraphPad Prism 9軟件進行統計學分析，組間比較采用非配對t檢驗和ANOVA檢驗，p < 0.05認為有統計學意義。通過受試者工作特征（ROC）曲線評估診斷效能，并利用主成分分析（PCA）構建復合甲基化評分。
結果
甲基化分析結果
在尿液樣本中，膀胱癌患者POU4F2、HOXA9、RBM46和TSGA10基因的啟動子甲基化水平均顯著高于健康對照組（分別約為對照組的2.2、9.0、3.6和6.1倍；所有p < 0.0001）。在血漿樣本中也觀察到類似的趨勢，但差異幅度小于尿液樣本（p = 0.0005–0.0278）。ROC曲線分析顯示，尿液甲基化對膀胱癌的診斷效能優異：POU4F2的曲線下面積（AUC）為0.97，HOXA9為0.95，RBM46為0.88，TSGA10為0.98（靈敏度95-100%，特異性80-100%；所有p < 0.0001）。PCA衍生的復合甲基化評分進一步提高了診斷準確性，AUC達到0.993（95% CI 0.974–1.000），靈敏度為100%，特異性為95%（p < 0.001）。
基因表達分析結果
基因表達分析顯示，與對照組相比，膀胱癌患者尿液中POU4F2和HOXA9基因的表達顯著下調（分別下降約7倍和9倍；p = 0.0099和p = 0.025），而RBM46和TSGA10基因的表達顯著上調（分別增加約2.5倍和2.3倍；p = 0.0037和p = 0.0114）。這表明啟動子高甲基化與POU4F2和HOXA9的表達沉默相關，而RBM46和TSGA10的高甲基化并未導致其表達下調，提示可能存在更復雜的基因調控機制。
細胞系驗證
在膀胱癌細胞系5637和EJ138中，所有四個基因均表現出高甲基化狀態，與文獻報道的膀胱癌細胞系普遍存在啟動子高甲基化一致，進一步支持了其在膀胱癌中的表觀遺傳學改變。
討論
本研究結果表明，POU4F2、HOXA9、RBM46和TSGA10基因在膀胱癌中存在顯著的甲基化改變和表達失調，尤其是在尿液cfDNA中檢測這些變化具有很高的診斷價值。尿液作為檢測樣本優于血漿，可能因其更接近腫瘤部位，含有更高濃度的腫瘤源性cfDNA。POU4F2和HOXA9的高甲基化導致其表達下調，符合經典的"高甲基化-基因沉默"模型。而RBM46和TSGA10在高甲基化的情況下表達反而上調，其機制可能涉及甲基化對非啟動子區域的影響、替代啟動子的使用或上游抑制因子的沉默等。單個基因及PCA復合評分均顯示出優異的診斷性能（AUC 0.88-0.993），靈敏度（95.45-100%）和特異性（80-100%）高，優于傳統的尿液細胞學檢查。這為非侵入性膀胱癌診斷生物標志物面板的開發提供了有力證據。
結論
本研究證實，檢測尿液cfDNA中POU4F2、HOXA9、RBM46和TSGA10基因的甲基化狀態和表達水平，能有效區分膀胱癌患者與健康人群，具有極高的診斷潛力。這種基于尿液的多基因甲基化與表達聯合分析策略，為膀胱癌的早期、無創診斷和監測提供了新的、有前景的方法。未來的研究需要在更大樣本量和更廣泛臨床場景中進行驗證，并探索其在預后判斷和復發監測中的應用價值。
