中性粒細(xì)胞是急性艱難梭菌感染（CDI）免疫應(yīng)答中的主導(dǎo)細(xì)胞。浸潤(rùn)結(jié)腸的中性粒細(xì)胞數(shù)量與組織損傷程度和嚴(yán)重CDI明確相關(guān)，但其加劇組織損傷的機(jī)制尚不清楚。本研究探討了表達(dá)嗅覺(jué)介素4（OLFM4）的中性粒細(xì)胞亞群（OLFM4⁺中性粒細(xì)胞）在CDI中的作用。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)顯示，感染小鼠血液中性粒細(xì)胞中Olfm4表達(dá)上調(diào)，且這些細(xì)胞表現(xiàn)出以脫顆�；�因高表達(dá)為特征的基因簽名。在感染小鼠中，OLFM4⁺中性粒細(xì)胞聚集于腸上皮細(xì)胞（IEC）損傷嚴(yán)重區(qū)域，且感染小鼠和患者血漿OLFM4水平顯著升高。體外實(shí)驗(yàn)中，OLFM4⁺中性粒細(xì)胞和重組OLFM4蛋白加劇了艱難梭菌毒素誘導(dǎo)的IEC損傷。本研究為中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的病理機(jī)制提供了新見(jiàn)解，并突出了OLFM4⁺中性粒細(xì)胞在惡化CDI誘導(dǎo)的IEC損傷中的作用。

艱難梭菌感染（CDI）是美國(guó)最常見(jiàn)的醫(yī)療相關(guān)感染。研究顯示，急性CDI期間外周血和結(jié)腸中性粒細(xì)胞數(shù)量增加與腹瀉延長(zhǎng)和更嚴(yán)重的臨床疾病相關(guān)。盡管中性粒細(xì)胞異質(zhì)性在其他感染和非感染性炎癥條件下已有研究，但CDI中的中性粒細(xì)胞異質(zhì)性尚未被探索。中性粒細(xì)胞在感染后迅速遷移至病灶，其激活觸發(fā)脫顆粒和胞質(zhì)內(nèi)顆粒預(yù)存蛋白的釋放。這些效應(yīng)物雖主要靶向病原體，但可能對(duì)宿主組織產(chǎn)生脫靶損傷。中性粒細(xì)胞增多是CDI的標(biāo)志且與更嚴(yán)重疾病相關(guān)，因此我們假設(shè)中性粒細(xì)胞和/或中性粒細(xì)胞衍生分子通過(guò)促進(jìn)組織損傷惡化CDI。

嗅覺(jué)介素4（OLFM4）是嗅覺(jué)介素結(jié)構(gòu)域蛋白家族成員，最初被鑒定為髓系發(fā)育中粒細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)的基因。OLFM4在多組織中表達(dá)，包括前列腺、骨骼、乳腺和胃腸道（GI），參與細(xì)胞增殖、黏附、凋亡和調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)。在骨髓（BM）和血液中，中性粒細(xì)胞是主要的Olfm4表達(dá)細(xì)胞類(lèi)型：在BM中，Olfm4在所有粒細(xì)胞前體表達(dá)，而在外周血中，OLFM4存在于部分中性粒細(xì)胞的特定顆粒中。OLFM4在胃腸道疾病中起重要作用。在炎癥性腸病患者中，OLFM4分泌到活動(dòng)性炎癥區(qū)域，而在小鼠中，OLFM4缺失（OLFM4^?/?）導(dǎo)致幽門(mén)螺桿菌感染和葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中細(xì)胞因子/趨化因子產(chǎn)生增加、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和更差結(jié)局。

為深入理解OLFM4如何影響CDI，我們檢測(cè)了OLFM4⁺中性粒細(xì)胞和重組OLFM4蛋白在CDI中的作用。我們發(fā)現(xiàn)CDI后中性粒細(xì)胞是主要的OLFM4表達(dá)細(xì)胞。利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)，我們發(fā)現(xiàn)表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞具有與中性粒細(xì)胞脫顆粒相關(guān)的基因特征，且這些中性粒細(xì)胞中僅有一個(gè)基因與Olfm4共調(diào)控。支持轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)CDI小鼠和患者循環(huán)OLFM4水平較對(duì)照升高。體外實(shí)驗(yàn)中，小鼠OLFM4⁺中性粒細(xì)胞和重組人OLFM4（rhOLFM4）加劇了艱難梭菌毒素誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞（IEC）損傷。我們的發(fā)現(xiàn)為CDI中中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的病理提供了新見(jiàn)解，并突出了OLFM4⁺中性粒細(xì)胞在CDI誘導(dǎo)的IEC損傷中的致病作用。

盡管中性粒細(xì)胞是小鼠和人類(lèi)BM和血液中主要的Olfm4表達(dá)細(xì)胞類(lèi)型，但在胃腸道中，Olfm4在兩種物種的小腸隱窩和人類(lèi)結(jié)腸上皮中被檢測(cè)到。為定義CDI后產(chǎn)生OLFM4的細(xì)胞，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估了感染后第1天未感染和感染野生型（WT）小鼠BM、血液和結(jié)腸中OLFM4⁺細(xì)胞比例。在未感染和感染小鼠中，OLFM4⁺細(xì)胞在BM、血液和固有層（LP）三個(gè)組織區(qū)室中持續(xù)約占中性粒細(xì)胞的8%–10%，而非中性粒細(xì)胞分?jǐn)?shù)中的OLFM4⁺細(xì)胞低于2%。CDI不影響B(tài)M和血液中OLFM4⁺中性粒細(xì)胞百分比，但其在LP中的比例下降。雖然CDI不影響B(tài)M中OLFM4⁺中性粒細(xì)胞數(shù)量，但血液中其數(shù)量有增加趨勢(shì)，且CDI后LP中其絕對(duì)數(shù)量顯著增加。這種不一致——LP中OLFM4⁺中性粒細(xì)胞數(shù)量增加但比例未增加——表明其積累不是選擇性招募的結(jié)果，而是反映了發(fā)炎結(jié)腸中中性粒細(xì)胞區(qū)室的整體擴(kuò)張。

OLFM4是中性粒細(xì)胞特定顆粒的組成成分，在有害刺激下釋放。這種釋放可能導(dǎo)致OLFM4⁺中性粒細(xì)胞比例減少和每個(gè)細(xì)胞OLFM4含量降低，如平均熒光強(qiáng)度（MFI）所測(cè)量。與此一致，我們觀察到CDI后LP中OLFM4⁺中性粒細(xì)胞百分比和其MFI均下降。這些數(shù)據(jù)提供了令人信服的證據(jù)，表明中性粒細(xì)胞是CDI后小鼠BM、血液和結(jié)腸中OLFM4的重要來(lái)源，并提示CDI誘導(dǎo)其從中性粒細(xì)胞細(xì)胞外釋放的情景。

我們生成了WT C57BL/6小鼠（未感染和急性CDI期間）BM、血液和結(jié)腸中性粒細(xì)胞的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜。此處，我們利用該單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNAseq）數(shù)據(jù)集對(duì)表達(dá)和不表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞進(jìn)行深入分析。使用基于熱擴(kuò)散勢(shì)的軌跡嵌入（PHATE）分析可視化不同發(fā)育階段的BM和血液中性粒細(xì)胞群體。Olfm4在BM中的前中性粒細(xì)胞、未成熟中性粒細(xì)胞和成熟中性粒細(xì)胞以及血液中的成熟中性粒細(xì)胞中表達(dá)，在BM未成熟和成熟中性粒細(xì)胞中檢測(cè)到最高表達(dá)。CDI不改變BM中性粒細(xì)胞Olfm4轉(zhuǎn)錄水平；然而，在循環(huán)中性粒細(xì)胞中，感染小鼠細(xì)胞Olfm4表達(dá)增加。批量RNA-seq研究比較艱難梭菌感染患者與健康對(duì)照時(shí)，也報(bào)告了循環(huán)白細(xì)胞中OLFM4轉(zhuǎn)錄本的類(lèi)似增加。盡管有這種轉(zhuǎn)錄上調(diào)，但血液中OLFM4⁺中性粒細(xì)胞比例或其MFI在CDI后未改變，提示轉(zhuǎn)錄后機(jī)制參與調(diào)節(jié)OLFM4蛋白表達(dá)。

在穩(wěn)態(tài)下，LP中中性粒細(xì)胞極少。因此，我們無(wú)法獲得足夠細(xì)胞對(duì)未感染小鼠結(jié)腸中性粒細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)。然而，對(duì)感染小鼠BM、血液和結(jié)腸中性粒細(xì)胞群體的PHATE分析顯示：（i）LP中性粒細(xì)胞處于發(fā)育軌跡的末端；（ii）雖然LP中性粒細(xì)胞Olfm4表達(dá)強(qiáng)度與BM成熟和血液中性粒細(xì)胞相似，但與BM成熟和外周血中性粒細(xì)胞相比，LP中表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞總數(shù)較少。

為表征表達(dá)或不表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄差異，我們對(duì)BM、血液和LP中性粒細(xì)胞（感染宿主）的scRNAseq數(shù)據(jù)進(jìn)行了基因集富集分析（GSEA）。與不表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞相比，表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞顯示與脫顆粒和先天免疫系統(tǒng)相關(guān)的基因上調(diào)約8至10倍，而與Clec7炎癥小體通路和IL-1加工相關(guān)的基因在不表達(dá)Olfm4的細(xì)胞中增加約七倍。進(jìn)一步調(diào)查后，我們發(fā)現(xiàn)表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞中中性粒細(xì)胞脫顆粒通路的富集是由Cd177、Ngp和Mmp8表達(dá)升高驅(qū)動(dòng)。盡管中性粒細(xì)胞脫顆�；�因的峰值表達(dá)發(fā)生在未成熟中性粒細(xì)胞中，但表達(dá)與不表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞之間的比較顯示，脫顆粒基因簽名在表達(dá)Olfm4組的未成熟和成熟BM及PB中性粒細(xì)胞中顯著上調(diào)。

CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白ε和β（CEBPε和CEBPβ）是中性粒細(xì)胞發(fā)育各階段中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子：CEBPε參與粒細(xì)胞生成的早期階段，而CEBPβ是晚期髓系分化的調(diào)節(jié)因子。BM、血液和LP表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞共同表達(dá)顯著更高的Cebpe，但較不表達(dá)Olfm4的細(xì)胞表達(dá)更少的Cebpb轉(zhuǎn)錄本。這些數(shù)據(jù)提示表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞可能更不成熟。因此，我們使用表征未成熟中性粒細(xì)胞的基因簽名分?jǐn)?shù)比較這些群體的scRNAseq數(shù)據(jù)。確實(shí)，表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞具有顯著更高的未成熟中性粒細(xì)胞基因簽名分?jǐn)?shù)，較不表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞。然而，當(dāng)按成熟狀態(tài)/組織區(qū)室分層基因表達(dá)時(shí)，明顯這種上調(diào)主要局限于BM的成熟表達(dá)Olfm4中性粒細(xì)胞，與不表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞相比。在成熟表達(dá)Olfm4中性粒細(xì)胞中導(dǎo)致更高未成熟基因簽名分?jǐn)?shù)的關(guān)鍵基因包括先前報(bào)道在前中性粒細(xì)胞和未成熟中性粒細(xì)胞階段表達(dá)的基因（即Anxa3、Dstn、Cd177和Anxa1）。

差異表達(dá)測(cè)試揭示了另一個(gè)非常有趣的特征。表達(dá)Olfm4的細(xì)胞具有幾種編碼顆粒和細(xì)胞質(zhì)蛋白的基因（即Cd177、Ngp、S100a8和S100a9）的更高轉(zhuǎn)錄水平。它們還顯示參與抗菌肽合成（即Camp）、調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附和分化（即Ifitm6）和代謝通路（即Adpgk和Tkt）的基因表達(dá)增加。然而，與不表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞相比，最大差異僅在于兩個(gè)基因，兩者在表達(dá)Olfm4中均>5 log倍增加且為該亞群獨(dú)有。這些基因是Olfm4（預(yù)期）和一個(gè)家鼠（Mus musculus）中的基因，稱(chēng)為Gm6999。值得注意的是，Gm6999編碼一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA），其基因組位置與Olfm4在同一染色體上，位于小鼠Olfm4基因座5′區(qū)域重疊的位點(diǎn)。盡管Gm6999功能尚未完全表征，但lncRNA在染色質(zhì)重塑和表觀遺傳調(diào)控中起重要作用，值得進(jìn)一步研究。這些數(shù)據(jù)揭示了表達(dá)與不表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)錄差異，包括與脫顆粒和未成熟相關(guān)的簽名。

除轉(zhuǎn)錄組學(xué)外，中性粒細(xì)胞表面蛋白已被用于表征不同亞群。因此，為進(jìn)一步表征OLFM4⁺和OLFM4^?中性粒細(xì)胞，我們用熒光標(biāo)記抗體對(duì)CD11b、CD177、CXCR2和CXCR4染色并進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)。選擇這些標(biāo)志物是因?yàn)樗鼈兲峁┲行粤＜?xì)胞激活、運(yùn)輸和定位的功能見(jiàn)解。具體而言，CD11b和CD177與中性粒細(xì)胞激活和脫顆粒相關(guān)，而CXCR2和CXCR4調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞在BM、循環(huán)和發(fā)炎組織之間的遷移。評(píng)估這些標(biāo)志物的表達(dá)使我們能夠確定OLFM4表達(dá)是否識(shí)別具有不同激活狀態(tài)或遷移潛力的中性粒細(xì)胞亞群。在未感染小鼠中，OLFM4⁺和OLFM4^?中性粒細(xì)胞之間CD11b、CD177、CXCR2或CXCR4的MFI無(wú)差異。在急性CDI期間，雖然所有三個(gè)組織中OLFM4⁺和OLFM4^?中性粒細(xì)胞上的CD11b、CD177和CXCR2 MFI相似，但CXCR4 MFI不同。在BM中，OLFM4⁺中性粒細(xì)胞具有較低的CXCR4，但在LP中，這些細(xì)胞具有較高的CXCR4，與相應(yīng)組織中的OLFM4^?中性粒細(xì)胞相比。已發(fā)表研究顯示，降低的CXCR4驅(qū)動(dòng)BM中性粒細(xì)胞動(dòng)員入血流，而在組織部位，CXCR4是老化中性粒細(xì)胞的標(biāo)志物，可促進(jìn)組織損傷。因此，我們的數(shù)據(jù)指向一種情景，即急性CDI增加OLFM4⁺中性粒細(xì)胞從BM的動(dòng)員，且在LP中，這些細(xì)胞表現(xiàn)出高炎癥表型。

血液中高比例的OLFM4⁺中性粒細(xì)胞與嚴(yán)重終末器官損傷和更差結(jié)局相關(guān)。因此，我們測(cè)試了中性粒細(xì)胞OLFM4表達(dá)對(duì)艱難梭菌相關(guān)上皮損傷的直接效應(yīng)。從WT和年齡匹配的OLFM4^?/?小鼠分選BM中性粒細(xì)胞以獲得高純度群體（>95%純度）。然后將中性粒細(xì)胞與小鼠上皮細(xì)胞系（CMT-93細(xì)胞）在有或無(wú)艱難梭菌毒素和脂多糖（LPS）的情況下在跨上皮電阻（TEER）測(cè)定板中培養(yǎng)。正如預(yù)期，艱難梭菌毒素導(dǎo)致IEC屏障損傷，如TEER降低所見(jiàn)。單獨(dú)LPS或LPS與中性粒細(xì)胞添加不利影響IEC屏障。然而，在艱難梭菌毒素與LPS和中性粒細(xì)胞組合中，毒素誘導(dǎo)的TEER下降在WT中性粒細(xì)胞存在下進(jìn)一步加劇，但當(dāng)使用OLFM4^?/?中性粒細(xì)胞時(shí)未觀察到。我們的結(jié)果與顯示OLFM4⁺中性粒細(xì)胞數(shù)量與終末器官損傷相關(guān)的研究一致，并支持OLFM4⁺中性粒細(xì)胞通過(guò)不利影響IEC屏障完整性的疾病增強(qiáng)作用（至少在體外）。

我們的流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)顯示，除結(jié)腸組織外，幼稚和艱難梭菌感染小鼠中OLFM4⁺中性粒細(xì)胞百分比在所有區(qū)室中相似，在結(jié)腸組織中，與未感染對(duì)照相比，艱難梭菌感染小鼠中比例降低。已知激活的中性粒細(xì)胞作為中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NETs）的一部分釋放OLFM4。我們的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞上調(diào)與脫顆粒相關(guān)的基因。因此，我們假設(shè)OLFM4在炎癥或組織損傷部位從中性粒細(xì)胞釋放，降低細(xì)胞內(nèi)OLFM4，從而降低組織中檢測(cè)到的OLFM4⁺中性粒細(xì)胞比例。

結(jié)腸組織的免疫組織化學(xué)顯示，急性CDI期間OLFM4⁺細(xì)胞分布在整個(gè)黏膜下層，在結(jié)腸損傷嚴(yán)重區(qū)域染色更強(qiáng)烈，與損傷較輕區(qū)域相比。上皮損傷評(píng)分高（評(píng)分>2.5，范圍0–4）的小鼠每個(gè)高倍視野OLFM4⁺細(xì)胞數(shù)多于損傷較輕者。此外，表明OLFM4蛋白可能從激活的結(jié)腸中性粒細(xì)胞釋放，艱難梭菌感染小鼠在疾病急性期顯示較未感染對(duì)照更高的血清OLFM4水平，且這些水平與循環(huán)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)。值得注意的是，與假攻擊小鼠相比，艱難梭菌感染小鼠結(jié)腸中性粒細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)OLFM4的MFI降低。這些發(fā)現(xiàn)共同提示OLFM4⁺中性粒細(xì)胞在CDI期間為脫顆粒做好準(zhǔn)備，導(dǎo)致OLFM4在炎癥部位細(xì)胞外釋放。

我們接下來(lái)量化了急性CDI患者血清OLFM4濃度，并將其與艱難梭菌檢測(cè)陰性的腹瀉個(gè)體比較。與我們的鼠模型相似，CDI患者系統(tǒng)性O(shè)LFM4水平顯著高于對(duì)照，且這些水平與循環(huán)WBC計(jì)數(shù)相關(guān)。先前研究顯示，OLFM4⁺中性粒細(xì)胞比例和循環(huán)OLFM4蛋白量與多種感染中更差結(jié)局相關(guān)，包括病毒（登革熱、流感和RSV）、細(xì)菌（幽門(mén)螺桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）和寄生蟲(chóng)（瘧疾）感染。在膿毒癥中，高百分比OLFM4⁺中性粒細(xì)胞見(jiàn)于有嚴(yán)重終末器官損傷者。雖然OLFM4⁺和OLFM4^?中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出相似的激活和吞噬能力，但它們?cè)贜ET形成傾向上不同。據(jù)報(bào)道，OLFM4從中性粒細(xì)胞釋放可由脫顆粒通路刺激誘導(dǎo)，也可通過(guò)NETosis進(jìn)行。雖然脫顆粒后OLFM4釋放需要強(qiáng)促分泌素，但OLFM4更易作為NET組分釋放。

為確定OLFM4蛋白在CDI發(fā)病機(jī)制中的作用，我們?cè)贗ECs上使用重組人OLFM4（rhOLFM4）：將人上皮細(xì)胞（Caco2細(xì)胞）與rhOLFM4在有和無(wú)艱難梭菌毒素的情況下孵育，并如上所述測(cè)量TEER。正如預(yù)期，艱難梭菌毒素導(dǎo)致IEC屏障損傷，TEER較單獨(dú)培養(yǎng)基對(duì)照顯著降低。單獨(dú)rhOLFM4蛋白（即使在高濃度50 μg/mL）不影響IEC屏障完整性。然而，當(dāng)與毒素共同給藥相同濃度時(shí)，rhOLFM4顯著加劇屏障破壞。這種rhOLFM4的附加效應(yīng)在較低濃度（5 μg/mL rhOLFM4）未觀察到。

我們研究最重要的發(fā)現(xiàn)是：（i）CDI增強(qiáng)外周血中性粒細(xì)胞中的Olfm4；（ii）表達(dá)Olfm4的中性粒細(xì)胞富含脫顆粒相關(guān)基因簽名；（iii）OLFM4⁺中性粒細(xì)胞以及重組OLFM4蛋白惡化艱難梭菌毒素誘導(dǎo)的IEC損傷。總之，這些數(shù)據(jù)提示OLFM4是致病性中性粒細(xì)胞亞群的標(biāo)志物，并暗示細(xì)胞外釋放的OLFM4通過(guò)影響IEC屏障在惡化CDI中的作用。在細(xì)胞培養(yǎng)中，從WT小鼠分離的中性粒細(xì)胞表現(xiàn)出