《Journal of Virology》：Intrahost HA polymorphisms and culture adaptation shape antigenic profiles of H3N2 influenza viruses
編輯推薦：
本研究發現臨床樣本中存在的宿主內遺傳多態性（特別是HA抗體結合位點）會導致顯著的抗原多樣性，而MDCK細胞培養會施加強純化選擇，減少變異多樣性并改變抗原特性。研究采用深度測序和高靈敏度polyPLA（proximity ligation assay）技術，直接對比臨床樣本與培養分離株的抗原性，揭示了當前疫苗株選擇流程中由培養適應引入的偏差，強調了直接分析未培養臨床材料對于提高季節性流感（H3N2）疫苗株選擇準確性的重要意義。
ABSTRACT
季節性流感A（H3N2）病毒因其快速進化導致的抗原漂移，使得疫苗有效性常因抗原不匹配而受限。準確表征流行病毒的抗原特性對于疫苗株選擇至關重要，然而常規的抗原表征依賴于在細胞系（如MDCK細胞）或雞胚中分離和擴增病毒，此過程可能引入適應性突變，改變抗原表位，從而無法真實反映人群中循環病毒的特性。本研究旨在探究宿主內遺傳多態性如何影響臨床樣本的抗原特性，以及MDCK細胞培養如何改變這些模式。
臨床樣本與病毒分離
研究分析了2017-2018年流感季節期間收集的60份甲型H3N2陽性鼻咽拭子樣本。病毒分離嘗試在兩種MDCK衍生細胞系（MDCK-SIAT1和人源化MDCK細胞，hCK）中進行。結果顯示，hCK細胞的病毒分離成功率（90%）顯著高于MDCK-SIAT1細胞（37.5%）。因此，后續的基因組和抗原分析均聚焦于hCK來源的分離株。最終，成功獲得45對匹配的臨床樣本-分離株對用于下游分析。
2017-2018流感季節共同流行的遺傳學上不同的H3N2譜系
對57個臨床樣本基因組進行HA基因分析顯示，病毒聚類為五個進化枝：3C.2a、3C.2a1、3C.2a2、3C.2a3和3C.2a4，其中3C.2a1（56.1%）和3C.2a2（22.8%）最為流行。值得注意的是，大多數循環病毒在遺傳上不同于該季節使用的疫苗株A/Hong Kong/4801/2014（屬于3C.2a進化枝）。所有病毒分離株均與其配對的臨床樣本緊密聚類，表明病毒分離過程大體上保留了整體的遺傳組成。然而，相對于疫苗株HK/14的差異主要集中在抗體結合位點，尤其是3C.2a2進化枝顯示出最高的變異度。
細胞培養誘導MDCK傳代病毒中的適應性突變和純化選擇
通過比較臨床樣本及其配對分離株的深度測序數據，評估了病毒分離對遺傳多樣性的影響。熵分析揭示，臨床樣本中存在顯著的宿主內多樣性，尤其在HA和NA基因中，而內部基因（如聚合酶復合體）變異性有限。在HA基因中，臨床樣本的多樣性高于分離株，特別是在五個主要抗體結合位點、HA1受體結合域和HA2莖桿域。大多數多態性HA殘基位于表面暴露區域，位于或接近經典抗體結合位點（如位點B的160位點，位點C的273、308、310位點等）。病毒分離過程施加了快速的純化選擇，顯著降低了宿主內遺傳多樣性。例如，在臨床樣本36-NPS中，HA 160位點存在K（35%）、I（27%）和T（21%）三種變異體的混合，而傳代后的分離株中T變異體占主導（92%），熵值從1.56降至0.38。這些發現表明，臨床樣本以異質性的病毒準種形式存在，而細胞培養分離通過選擇性富集適應性變異體，減少或排除了代表體內病毒多樣性的變異體。
MDCK細胞中的培養適應改變H3N2流感病毒的抗原譜
為了評估MDCK細胞分離過程中宿主內多態性的變化是否改變抗原特性，研究對24個病毒分離株進行了常規血凝抑制（HAI） assay分析，并對代表五個遺傳進化枝的16對臨床樣本-分離株對進行了高靈敏度的polyPLA分析。HAI抗原圖譜顯示，大多數分離株與其相應的遺傳進化枝參考株抗原性接近。相比之下，基于polyPLA的抗原圖譜揭示了更大的異質性，臨床樣本顯示出更廣泛的抗原變異譜。在16對測試的配對中，僅5對顯示出小于2個單位的抗原距離（每個單位代表polyPLA滴度的兩倍變化），其余配對的抗原距離范圍在2.1至7.1個單位之間，表明存在明顯的抗原特性差異。分子分析表明，這些抗原差異主要與HA和NA的序列變異相關。例如，臨床樣本36-NPS與其配對分離株36-hCK之間存在1.6個單位的抗原距離；臨床樣本在抗體結合位點B的HA 160位點存在K/I/T混合群體，而分離株36-hCK中則以160T為主。這些發現證明，MDCK細胞中的病毒分離改變了遺傳多樣性臨床群體中的變異體組成，減少了宿主內多樣性，并導致了可測量的抗原變化。
臨床樣本中準種驅動的抗原變異
研究假設臨床樣本中的宿主內多態性產生了一個共識序列無法捕獲的抗原表型連續體。為了驗證這一點，研究聚焦于HA蛋白160位點（位于抗體結合位點B），該位點在數據集中顯示出最高的熵值。利用反向遺傳學（PR8 + 2系統），研究人員構建了三種重組病毒，分別攜帶該位點自然發生的一種變異體（HA:160K, HA:160T, 或 HA:160I）。為了模擬臨床樣本中觀察到的準種組成，創建了11個病毒群體：三個純變異體和八個特定比例的混合物，包括一個復制臨床樣本36-NPS組成（rg160K:rg160T:rg160I; 35:27:21）的混合物。抗原譜分析（使用微量中和MN和polyPLA assay）顯示，HA 160位點的變異使抗原表型改變了約1-2個單位。純變異體在抗原空間中占據不同的位置，而混合群體則根據主導殘基顯示出中間或偏移的位置。然而，它們的抗原特性并不遵循簡單的比例平均。例如，富含rgT160的混合物（10:80:10）和（50:25:25）聚集在rgT160（0:100:0）病毒附近，抗原距離分別僅增加0.18和0.56個單位。詳細的MN滴度證實了160位點多態性的非加性抗原效應。混合群體產生了一個連續的滴度范圍（1:160–1:640），該范圍并不隨變異體組成線性縮放。這些發現表明，HA 160位點的多態性以非加性方式重塑抗原識別，混合準種表現出不同于克隆病毒的新興抗原譜，強調了宿主內多樣性如何促進流感抗原復雜性。
討論
本研究直接證明了臨床甲型H3N2樣本中的宿主內多態性導致可測量的抗原多樣性，而MDCK細胞中的病毒繁殖施加了強純化選擇，改變了遺傳和抗原特性。通過結合深度測序和血清學分析（包括高靈敏度polyPLA），研究表明臨床樣本存在顯著的宿主內變異，特別是在表面暴露的HA殘基上。MDCK細胞中的病毒分離通過選擇性富集適應性變異體顯著降低了這種多樣性，并且關鍵位點（如HA:160）的多態性產生了無法僅從共識序列預測的非線性抗原結果。這些發現揭示了當前全球流感監測和應對系統（GISRS）工作流程中一個關鍵的偏差來源，該流程主要依賴傳代分離株進行抗原表征。培養誘導的選擇性富集特定HA變異體，并模糊了體內存在的更廣泛的抗原景觀。研究結果支持采用直接從未培養臨床材料評估抗原性的方法，以更準確地捕捉人類感染中循環的多樣性。此外，準種混合物的實驗重建表明，單個位點的多態性可以產生非線性的抗原效應，這可能是由于HA三聚體內單體共組裝或糖基化改變導致的表位相互作用。PolyPLA被證明是直接評估臨床材料抗原關系的強大工具，比常規HAI或MN assay能捕獲更廣泛的抗體-抗原相互作用。總之，這些發現強調了將病毒作為動態、異質性群體進行表征的重要性，以及培養適應性如何扭曲用于指導疫苗株選擇的抗原數據。直接整合血清學、基因組和結構分析來表征臨床樣本中的病毒，將為循環病毒的抗原景觀提供更真實的表征，這對于提高流感疫苗株選擇的精確性至關重要。
MATERIALS AND METHODS
臨床樣本：鼻咽拭子樣本來自2017-2018年流感季節，由密西西比州公共衛生實驗室通過全州范圍的流感監測網絡收集。樣本基于甲型H3N2 qRT-PCR陽性且剩余體積足夠進行病毒分離和全基因組測序而選擇。
細胞：使用了三種MDCK衍生細胞系：人源化MDCK細胞（hCK）、MDCK-SIAT1細胞和MDCK-CCL34細胞。
病毒和雪貂血清：使用了四個參考病毒株：A/Hong Kong/4801/2014 (H3N2) (HK/14), A/Singapore/IFNIMH-16-0019/2016 (SGP/16), A/Kansas/14/2017 (KS/17), 和 A/New Mexico/14/2018 (NM/18)。雪貂血清通過鼻內感染雪貂并收集感染后四周的血清制備。
病毒分離：按照WHO指南將臨床樣本接種到hCK和MDCK-SIAT1細胞中進行病毒分離。
核酸提取：使用MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit從鼻咽拭子樣本中提取病毒RNA。
定量RT-PCR：使用針對甲型流感病毒M基因的引物和探針進行qRT-PCR檢測。
反向遺傳學產生重組病毒：使用八質粒系統，將來自臨床樣本36-NPS的HA和NA基因（在160位點構建K、T、I三種變異體）與A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1)的六個內部基因片段組合，拯救出6:2重配病毒。
HA和HAI assay：使用0.75%豚鼠紅細胞按照WHO標準程序進行。
polyPLA assay：如前所述進行。簡要來說，將針對參考株的多克隆雪貂血清和NP特異性單克隆抗體進行生物素化并制備成鄰近探針。病毒樣本與探針混合物孵育過夜后，進行連接、蛋白酶處理和定量PCR檢測。
MN assay：按照WHO方案進行。將系列稀釋的血清與100 TCID50的病毒混合孵育后，加入hCK細胞，18-20小時后通過ELISA檢測病毒復制抑制情況。
新一代測序（NGS）和數據分析：使用甲型流感通用引物通過兩步RT-PCR擴增全基因組。使用Illumina Nextera DNA Flex Library Prep Kit制備文庫，在NextSeq 500/550系統上測序。使用IRMA（cdc iterative refinement meta-assembler）流感模塊進行 reads 處理、組裝和共識序列生成。使用DiversiTools分析宿主內單核苷酸變異（iSNV）和氨基酸多態性。
遺傳多樣性：通過多序列比對識別核苷酸和氨基酸替換。使用DiversiTools計算每個氨基酸位點的比例豐度。
香農熵：基于可變位點的等位基因頻率計算香農熵，以量化遺傳多樣性。
系統發育分析：使用BEAST v1.10.5對所有八個基因片段進行貝葉斯系統發育推斷，構建最大置信度（MCC）樹。
抗原圖譜：使用基于網絡的抗原圖譜工具（
http://sysbio.missouri.edu/AntigenMap），根據HAI、MN或polyPLA滴度數據構建抗原圖譜。
結構可視化：使用PyMOL以晶體結構4WE8為模板進行可視化。
統計分析：使用DiversiTools pipeline進行多態性分析。使用R語言ggtree包生成和可視化系統發育樹。使用Python自定義腳本創建多態性和熵圖。
