《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Optimizing mRNA delivery with targeted elastin-like polypeptide–based LENN formulations: Insights into the endocytosis mechanism
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本文系統闡述了層狀彈性樣多肽核酸納米顆粒（LENN）作為非病毒載體的優勢，通過表皮生長因子受體（EGFR）靶向遞送mRNA，并深入解析其以網格蛋白（clathrin）介導的內吞作用為主的內化途徑。研究證實LENN具備高封裝效率、凍干穩定性及體內外高效轉染能力，脂質組學分析進一步揭示了磷脂動態重塑在內吞及內體逃逸中的關鍵作用，為開發可規模化生產、生物可再生的基因遞送系統提供了新策略。
結構表征與物理性質
研究首先聚焦于LENN納米顆粒的結構與物理性質表征。通過動態光散射（DLS）和冷凍電鏡（Cryo-EM）分析發現，LENN的粒徑強烈依賴于前體溶液濃度。在低濃度下（0.0025 mg/mL mRNA），LENN NP10（氮磷比N:P為10）的粒徑可降至約100納米，且表現出較低的多分散指數（PDI ≤ 0.3），表明顆粒均一性良好。封裝效率測試顯示，隨著N:P比增加，mRNA的封裝效率提升，尤其在經歷肝素挑戰后，LENN NP10及以上比例的制劑仍能保持近80%的封裝效率，凸顯其結構穩定性。Zeta電位測量表明，較高N:P比的LENN表面正電荷更高，這可能有助于其與帶負電的細胞膜相互作用并保持膠體穩定性。冷凍電鏡圖像揭示了LENN NP10由2-3納米的初級顆粒聚集形成約70-100納米的簇狀結構，而凍干處理后的顆粒尺寸未發生顯著變化，證明了其良好的凍干復溶穩定性。相比之下，使用較短聚精氨酸片段（CD-PLR5）制備的顆粒雖然初始粒徑更小（30-50納米），但穩定性遠遜于CD-PLR10基制劑，因此后續研究均采用CD-PLR10。
LENN內吞機制的確定
為了闡明LENN的細胞內吞途徑，研究團隊利用Cy5.5標記的V24-EGF和MFP-488標記的mRNA，通過共聚焦顯微鏡和流式細胞術觀察了EGFR高表達的T24膀胱癌細胞對靶向LENN的攝取情況。結果表明，V24-EGF LENN能被T24細胞高效內化，而游離表皮生長因子（EGF）的受體阻斷則顯著抑制此過程，證實了攝取依賴于EGFR的特異性結合。采用不同內吞途徑抑制劑的研究揭示，網格蛋白介導的內吞作用抑制劑氯丙嗪（chlorpromazine, 5.0-50.0 μM）能劑量依賴性地顯著降低mRNA和ELP的細胞內熒光信號，最高濃度下mRNA內化率降至5.0%。與之相對，小窩蛋白（caveolae）介導的內吞抑制劑菲律賓菌素（filipin）和巨胞飲作用（macropinocytosis）抑制劑細胞松弛素D（cytochalasin D）即使在最高測試濃度下也未引起明顯的劑量依賴性攝取抑制。這些結果強有力地表明V24-EGF LENN主要通過網格蛋白介導的內吞途徑進入細胞。有趣的是，盡管LENN表面呈現多價EGF，其內吞機制仍遵循單體EGF經典的網格蛋白途徑，這與某些多價載體觸發非經典途徑的情況不同，提示內吞響應具有背景依賴性。此外，帶正電的Polyion復合物通過非特異性吸附內吞進入細胞，其mRNA信號呈點狀分布。
LENN的體外與體內性能評估
對LENN遞送性能的評估顯示，V24-EGF LENN（特別是NP10和NP15）在T24細胞中能實現高效的螢火蟲熒光素酶（Fluc）mRNA表達，其熒光素酶活性顯著高于未處理對照組，并與通過非特異性途徑進入的Polyion復合物相當，證明了靶向LENN在特異性攝取后能成功實現內體逃逸和基因表達。一個關鍵發現是，含有10%甘油作為凍干保護劑的V24-EGF LENN NP10，在凍干并于-20°C儲存3天后復溶，其mRNA表達效率與新鮮制備的溶液無顯著差異，這為解決LNP（脂質納米粒）等載體對超低溫冷鏈的依賴提供了有前景的替代方案。在體內研究中，通過膀胱內灌注將標記的LENN遞送至攜帶MB49原位膀胱癌的小鼠模型。結果顯示，與未靶向的V40 LENN相比，V24-EGF LENN在腫瘤部位表現出顯著更高的siRNA（MFP-488）和ELP（Cy5.5）熒光信號強度，且在30分鐘至1小時的灌注時間內信號持續增強，突出了靶向遞送在克服膀胱內給藥挑戰（如粘液層屏障和有限駐留時間）中的高效性。
LENN處理細胞的脂質組學分析：內吞機制的深入見解
為了更深入地理解LENN內吞過程中的細胞響應，研究對經V24-EGF LENN、V40 LENN和Polyion復合物處理的T24細胞進行了脂質組學分析。結果顯示，在0至4小時的時間尺度上，所有處理均引發了細胞膜脂質的動態重塑。最顯著的變化出現在磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰肌醇（PI）和鞘磷脂（SM）等脂質類別中。研究發現，不飽和PC脂質含量隨時間增加，而飽和PC減少，這種變化有助于增強膜流動性，這對于內吞過程中的膜彎曲和囊泡形成至關重要。特別是溶血磷脂酰膽堿LPC (18:0)在V24-EGF LENN處理1小時后顯著升高，其圓錐形分子結構有利于誘導膜外葉產生正性固有曲率，促進初始內陷。PI (38:5)的增加和PI (36:1/O-37:1/P-37:0)的減少，提示磷酸肌醇代謝參與調控，例如磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）已知在網格蛋白包被小窩形成中起關鍵作用。鞘磷脂（SM）水平的普遍升高可能與信號轉導或脂筏形成有關，但其在網格蛋白介導的內吞中并非主要角色，可能反映了更廣泛的細胞應激或通訊。尤為重要的是，僅在靶向V24-EGF LENN處理組中觀察到磷脂酰絲氨酸（PS）和磷脂酰乙醇胺（PE）的顯著變化。PS在0小時升高，1小時下降，4小時再次上升，暗示其可能參與早期內吞囊泡的成核與裂變（0小時），以及晚期內體過程（4小時）。PE（40:4和40:5）在0和1小時升高，4小時下降，PE因其可融合特性，被認為在促進LENN cargo的內體逃逸中發揮重要作用。這些脂質變化模式與共聚焦顯微鏡觀察到的現象一致：0小時mRNA與ELP在內體中共定位，1小時信號開始擴散（提示逃逸），4小時部分殘留共定位。脂質本體論（LION）富集分析進一步證實，V24-EGF LENN處理顯著富集了與正性固有曲率、膜彎曲能力以及內質網相關脂質特征，而V40 LENN和Polyion復合物處理則分別顯示出與膜流動性或表面水平膜重塑相關的脂質適應。這些數據共同表明，靶向LENN通過EGFR觸發了特定的、動態的膜脂質重組，這些重組支持了高效的網格蛋白介導的內吞和后續的內體逃逸過程。
結論
綜上所述，這項研究詳細闡述了基于彈性樣多肽（ELP）的LENN系統作為一種高效、靶向的非病毒基因遞送平臺的潛力。其優勢在于可規模化生產、使用生物可再生材料、具備良好的凍干穩定性以及明確的內吞機制——主要通過網格蛋白介導的途徑。深入的脂質組學分析揭示了細胞膜脂質動態重塑在LENN內吞和細胞內運輸中的重要作用，特別是PS和PE在早期內吞和內體逃逸中的潛在功能。這些發現不僅深化了對納米顆粒-細胞相互作用的理解，也為優化下一代基因治療載體，特別是針對膀胱癌等疾病的靶向遞送系統，提供了重要的理論依據和實踐指導。
