基因家族擴張是功能多樣化的關鍵，然而，旁系同源基因在代謝途徑中的具體貢獻往往不清晰。在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中，擴張的O-酰基轉移酶（O-acyltransferase, OAC）基因家族——這類酶負責將酰基基團轉移至羥基化底物——盡管已被推測與脂質代謝相關，但其功能仍很大程度上未被表征。O-酰基轉移酶是酰基轉移酶的一個亞類，催化酰基基團轉移到羥基上，與催化酰基轉移到胺基上的N-酰基轉移酶形成對比。O-酰基轉移酶在細胞環境中無處不在，參與從細菌生物膜生長到果蠅Wnt信號傳導，再到人類膽固醇轉化為膽固醇酯等多種途徑。秀麗隱桿線蟲擁有幾類膜結合O-酰基轉移酶家族，如mboa、mom和oac家族。其中，最大但研究最少的類別是OAC基因家族，其包含一個不同的蛋白質結構域，即酰基轉移酶3結構域（InterPro IPR002656; Pfam PF01757）。該家族在秀麗隱桿線蟲基因組中包含59個蛋白質編碼基因。

化學通訊對于秀麗隱桿線蟲的繁殖至關重要。線蟲利用兩類信息素：非揮性的蛔苷（ascaroside）信息素，調控發育和社會行為；以及揮發性性信息素（volatile sex pheromones, VSPs），指導遠距離的配偶尋找。VSPs由耗盡自身精子的雌雄同體/雌性專門產生，用于吸引雄性。其化學結構和生物合成途徑仍然難以捉摸。許多研究表明，OACs對于昆蟲揮發性信息素的生產至關重要。OAC驅動信息素生物合成在其他物種中的保守性引出了一個引人入勝的問題：秀麗隱桿線蟲的OAC家族基因是否類似地調控信息素信號？為什么OAC家族在秀麗隱桿線蟲中發生了擴張？這種擴張是反映了功能冗余、亞功能化，還是線蟲生態學中獨特的新適應？

為了系統地研究OAC基因家族，本研究獲取或生成了所有59個蛋白質編碼oac基因的敲除品系。對剩余的56個基因，利用CRISPR/Cas9介導的基因組編輯技術創建了95個突變等位基因。這些品系為探究OACs在秀麗隱桿線蟲中的功能作用提供了全面的資源。

通過比較蛋白質序列并構建蛋白質系統發育樹，研究人員理解了基因/蛋白質之間的親緣關系。研究發現，OAC家族的定義特征是酰基轉移酶3結構域，這是一個對酰基基團轉移至關重要的保守催化基序。除了已命名的oac基因外，還鑒定出三個額外包含此OAC特異性酰基轉移酶3結構域的基因：bus-1、rhy-1和nrf-6。這些基因在OAC基因類別命名之前已被表征，功能與酰基轉移酶活性無關。基于其共享的結構域架構，將bus-1、rhy-1和nrf-6納入OAC基因家族。包括這些基因后，OAC家族共有63個基因，其中包含4個假基因（oac-18、oac-33、oac-47和oac-60）。

所有59個OAC蛋白質編碼基因都具有一個酰基轉移酶3結構域。OACs通常根據其非酰基轉移酶3結構域的架構分為兩組：42個OACs具有一個與C端SGNH水解酶結構域（InterPro IPR043968）耦合的酰基轉移酶3結構域，而15個OACs具有一個與N端耐氟西汀鼻（nose resistant-to-fluoxetine, NRF）結構域（InterPro IPR006621）耦合的酰基轉移酶3結構域。SGNH水解酶結構域常與碳水化合物修飾相關，而NRF結構域則暗示了這些酶的多樣化功能角色。研究發現，所有具有酰基轉移酶3結構域的OACs同樣具有一個保守的催化組氨酸殘基，以及在酰基轉移酶3結構域中保守的Ser (S)-Tyr (Y)-His (H)殘基組合（SYH催化基序）。串聯重復的基因，如oac-21/oac-22/oac-23；oac-13/oac-16；oac-25/oac-28傾向于聚集在一起，暗示了最近的基因復制事件。然而，整體的系統發育結構與基因組位點的相關性不強，表明旁系同源物之間存在功能分化。

為了系統研究OAC基因家族，研究人員獲取或生成了所有59個蛋白質編碼oac基因的敲除品系。現有的bus-1(e2678)、nrf-6(sa525)和rhy-1(ok1402)突變體從秀麗隱桿線蟲遺傳學中心（CGC）獲得。對于剩余的56個基因，采用CRISPR/Cas9介導的基因組編輯技術，創建了95個突變等位基因。使用了兩種策略：1) 非同源末端連接以產生幾百個堿基對的缺失；2) 同源定向修復以引入多個早期終止密碼子或移碼。這些品系為探究OACs在秀麗隱桿線蟲中的功能作用提供了全面的資源。

除了oac-16(sy1342)，大多數oac突變體品系沒有表現出可觀察到的行為表型。該等位基因的純合線蟲表現出運動缺陷，其特征是遠離孵化地點的運動受限。然而，另外兩個oac-16等位基因（sy1341，sy1471）缺乏這種運動性缺陷，表明sy1342表型源于脫靶突變，而非oac-16功能喪失。由于該缺陷與信息素信號無關，因此在GC-MS分析中仍將oac-16(sy1342)品系納入信息素提取物。

鑒于OACs在其他物種的脂質修飾和信息素生物合成中已確立的作用，研究人員假設秀麗隱桿線蟲的OACs可能類似地調控VSPs的生產。通過行為學 assays和GC-MS分析，鑒定出四個OACs是VSPs生物合成所必需的。

具體而言，從缺乏自身精子的雌雄同體（以避免精子來源的信號抑制VSPs生產）中提取信息素，并評估其吸引野生型雄性的能力。采用標準化的化學吸引assay與him-5(e1490)雄性（oac基因野生型）進行評估。在篩選的59個oac突變體（56個命名oac基因以及bus-1、nrf-6、rhy-1）中，大多數保留了正常的信息素活性。引人注目的是，染色體I上的四個基因的突變體——兩個串聯旁系同源物（oac-13和oac-16）以及兩個幾乎相同的旁系同源物（oac-25和oac-28）——表現出有缺陷的揮發性性信息素生產，表明在生物合成、分泌或前體分子或VSPs生產所需必需營養素的可用性方面存在損傷。oac-13和oac-16位于“正向”鏈上，相距179千堿基，而oac-25和oac-28位于反向鏈上，相距6.4千堿基。由于它們幾乎相同的基因組序列（99%相似性）和在染色體I上的緊密接近，oac-25和oac-28難以使用標準遺傳修飾方法單獨靶向。此外，它們的編碼序列（CDS）100%相同，促使研究人員分析一個oac-28和oac-25雙突變體。

從篩選中發現，來自oac-13和oac-16單突變體以及oac-28 oac-25雙突變體的信息素提取物，與野生型提取物相比，引起雄性吸引顯著減少，而oac-28單突變體則沒有。更大規模的試驗證實了這些缺陷。隨后評估了一個oac-16 oac-13雙突變體，其表現出與相應的單突變體相似水平的雄性吸引缺陷。由于oac-13和oac-16與其雙突變體顯示出相似的雄性吸引，研究人員測試了oac-16 oac-28 oac-25三突變體。引人注目的是，這個三突變體幾乎完全失去了雄性吸引力。另外兩個突變體，oac-49和oac-55，在最初的小規模篩選中表現出輕微的減少，但這些減少在大規模試驗中沒有統計學顯著性。隨后采用雙選擇assay，比較來自6日齡成年N2雌雄同體的野生型VSPs提取物與來自oac突變體的提取物。雄性（him-5）強烈偏好野生型提取物勝過來自oac-13和oac-16單突變體、oac-16 oac-13和oac-28 oac-25雙突變體以及oac-16 oac-28 oac-25三突變體的提取物。這些assay結果進一步證實了它們的信息素缺陷。

OAC-13和OAC-16共享60.18%的氨基酸序列同一性，而OAC-25和OAC-28是相同的蛋白質。進一步的比較顯示，OAC-25/OAC-28與OAC-16有70.45%的同一性，與OAC-13有57.78%的同一性，突出了這些結構同源蛋白質之間顯著的序列保守性。此外，所有四個基因聚集在染色體I上一個保守的基因組區域內（13.07至13.20 cM）。

秀麗隱桿線蟲的雌雄同體僅在耗盡自身精子后產生VSPs，這在野生型個體中發生在成年后5至6天，或在oac突變體中發生在6至8天。相比之下，雌雄異體物種的處女成年雌性持續分泌這些VSPs直到交配。為了鑒定候選VSPs，研究人員對與信息素生產相關的階段的秀麗隱桿線蟲和雷曼氏秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis remanei）品系培養物進行了頂空固相微萃取（SPME）結合GC-MS分析。

跨oac突變體品系，產卵在5-7天持續低水平進行，而野生型大多在第5天停止，表明生殖期有適度但可重復的延長。育雛大小的減少是等位基因特異性的。然而，其他CRISPR終止密碼子敲入突變體，即一個oac-16單突變體、oac-13; oac-16雙突變體和oac-16; oac-25; oac-28三突變體，沒有顯示這種減少，表明該效應反映了刪除策略的后果或脫靶效應，而非oac-16基因功能。從孵化后24小時到68小時的體細胞生長——長度、寬度和面積——與N2沒有差異。總之，oac突變體表現出生殖期適度延長，自身精子耗盡延遲，沒有檢測到體細胞生長缺陷。信息素在自身精子耗盡后收集。

信息素陽性樣品包括：1) 野生型秀麗隱桿線蟲N2品系的6日齡成年雌雄同體，其為自身精子耗盡型；2) 秀麗隱桿線蟲daf-22(m130)突變體的6日齡成蟲，其在蛔苷生物合成中有缺陷，以控制蛔苷信號在GC-MS中的貢獻；3) 野生型雷曼氏秀麗隱桿線蟲（一種雌雄異體物種）的1日齡處女成年雌性。信息素陰性對照包括：1) 保留自身精子的1日齡成年秀麗隱桿線蟲雌雄同體；2) 秀麗隱桿線蟲幼蟲（L2–L4階段），代表非生殖發育階段；3) 雷曼氏秀麗隱桿線蟲成年雄性；4) 雷曼氏秀麗隱桿線蟲的混合性別1日齡成蟲，其中交配應抑制VSPs生產。GC-MS分析揭示了兩個保守的色譜峰（峰1/2），其 exclusively 存在于所有信息素陽性樣品中，并在所有陰性對照中缺失。盡管峰1/2的化學身份尚未解析，但保留時間（t_R）對齊和相同的質譜圖確認了它們在不同物種和品系中的身份，表明這些化合物代表了與先前報道的雄性吸引階段相關的保守揮發性化學物質。

為了確定oac-13、oac-16、oac-25和oac-28是否影響VSPs的生產或分泌，研究人員使用SPME-GC-MS分析了行為上有缺陷的oac突變體的信息素提取物。為了量化結果，分析了GC洗脫時間、MS譜圖以及源自分析物離子（m/z67.0和82.0）的提取離子色譜圖（EICs）的積分峰面積。

oac-13或oac-16的單突變體顯示峰1/2的豐度與野生型對照相比顯著減少。oac-16 oac-13雙突變體沒有顯示進一步的減少，與行為學 assays一致，而雙突變體損害雄性吸引的程度與單突變體相似。相比之下，oac-28 oac-25雙突變體保留了峰1，但幾乎失去了峰2。oac-16 oac-28 oac-25三突變體失去了 both 峰1/2，與信息素陰性對照的GC-MS數據（如秀麗隱桿線蟲L4和1日齡成蟲）相匹配。

行為學 assays和生化證據表明這四個OAC基因具有不同的作用：oac-13/oac-16作用于上游，影響一個峰1/2都需要的共同前體，而oac-25/oac-28作用于下游，特異性調控峰2。oac-16 oac-13雙突變體中缺乏疊加效應暗示它們在一個共同的途徑或復合物中起作用，兩個旁系同源物對于合成峰1/2都是必需的。另一方面，oac-25/oac-28具有相同的蛋白質序列并且在染色體上位置接近，可能在峰2的生產中共享冗余作用。

oac-16、oac-25和oac-28的表達模式和階段**

構建了oac-16、oac-25和oac-28的轉錄報告基因以表征其時空表達。所有三個基因均在雌雄同體的縫細胞（特化的側線表皮細胞）中表達，其中oac-16和oac-28顯示從胚胎發生到成年期的組成型表達。相比之下，oac-25的表達局限于胚胎后階段，暗示階段特異性調控。此處顯示的胚胎、L1和L2階段的圖像是從同一個體線蟲在其早期發育過程中捕獲的。在雌雄同體和雄性之間未檢測到表達差異，暗示要么存在額外的生物合成酶，要么存在性別特異性的底物參與VSPs生產。技術挑戰阻礙了oac-13轉錄報告基因的生成，可能由于其啟動子區域序列的序列組裝問題。盡管存在此限制，oac-16、oac-25和oac-28在縫細胞中的穩健表達支持了一個模型，即VSPs在縫細胞中合成。

oac-13/16和oac-25/28在揮發性性信息素生產中的遺傳冗余和功能作用**

研究結果證明，四個OAC家族基因——oac-13、oac-16、oac-25和oac-28——是揮發性性信息素生產所必需的。這些基因可能通過影響分泌途徑、限制必需生物合成前體的可用性或改變信息素生成關鍵營養素的代謝供應來發揮作用。

第一個模型提出，OAC-13和OAC-16介導一個共享的或不同的前體的生產，該前體在峰1/2途徑中被利用，而OAC-25和OAC-28在下游作用，特異性地將此前體轉化為峰2。對于同時需要OAC-13和OAC-16有兩種可能的解釋。首先，單突變體和雙突變體之間的表型相似性暗示這些基因可能在一個共享的生化途徑中順序作用。例如，OAC-16可能依賴于OAC-13產生的底物，反之亦然，因此，破壞任一基因都會暫停該途徑。或者，OAC-13和OAC-16可能需要形成異源多聚體以實現前體合成。第二個模型表明，OAC-25/OAC-28可能有助于維持最低水平的峰1生產，因為單獨失去OAC-13/OAC-16會減少但不消除峰1，而三突變體（缺乏OAC-16、OAC-25和OAC-28）則完全失去峰1。OAC-25和OAC-28是幾乎相同的旁系同源物，可能起源于秀麗隱桿線蟲中最近的串聯復制事件。這種序列同一性（100%）和基因組接近性——在染色體I的反向鏈上僅相距6.4 kb——強烈暗示這些基因在功能上是冗余的。由近期復制產生的基因通常作為遺傳“備份”，為必需途徑提供穩健性并緩沖有害突變。

使用OAC-25和OAC-28蛋白質序列進行BLAST，研究人員在秀麗隱桿線蟲物種中鑒定了同源物，并在雷曼氏秀麗隱桿線蟲、布里格斯秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis briggsae）、布倫納秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis brenneri）和尼戈尼秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis nigoni）中找到了匹配。在密切相關的物種中沒有發現相同的蛋白質；最接近的匹配是布里格斯秀麗隱桿線蟲蛋白質CBG10742（54.47%序列同一性）。研究人員也使用了OAC-13和OAC-16的BLAST，但沒有發現相同的蛋白質，且沒有蛋白質相似性超過60%。雖然雷曼氏秀麗隱桿線蟲產生的VSPs通過GC-MS保留時間和質譜法與秀麗隱桿線蟲無法區分，但在其基因組中沒有發現oac-13、oac-16、oac-25或oac-28的高度保守直系同源物。這種遺傳差異表明，保守的信息素成分是通過功能趨同的途徑或共享的催化基序產生的。

為了表征進化復制事件，研究人員對18個顯示與OAC-25/OAC-28有>92%查詢覆蓋率和>50%氨基酸相似性的直系同源蛋白質進行了序列分析。這些蛋白質在多個物種中顯示出保守的復制模式。在雷曼氏秀麗隱桿線蟲中，鑒定出兩個高度保守的旁系同源對（96.2%和98%相同）。布里格斯秀麗隱桿線蟲顯示出更高的保守性，一個旁系同源對表現出99.6%相似性，另外三個旁系同源物顯示出近乎完美的同一性（100%和99.6%）。所有映射的基因在基因組中都位于其旁系同源物附近。這些序列保守水平強烈暗示了兩個物種中近期、譜系特異性的基因復制事件。在分析中，只有oac-25和oac-28的雙突變體影響VSPs合成，這與基因復制在進化中的雙重作用一致：在保持穩定性的同時實現創新。

先前的工作確定，激光消融Z1和Z4——體細胞生殖腺的前體細胞——會廢除雌雄同體的雄性吸引力，而消融種系前體Z2和Z3沒有效果，暗示體細胞生殖腺參與揮發性信息素生物合成。與此發現一致，無 vulva 的雌雄同體保留野生型吸引力，排除了 vulva 作為VSPs分泌開口的可能性。oac-16、oac-25和oac-28的表達分析將這些基因定位到縫細胞。因此推斷縫細胞是VSPs生物合成的關鍵部位，并且可能是分泌的VSPs的來源。

秀麗隱桿線蟲雌雄同體的體細胞生殖腺包括八個不同的結構區域，包括與 vulva 和側表皮的縫細胞、子宮、受精囊閥、受精囊、輸卵管、卵巢鞘和遠端尖細胞的連接。值得注意的是，子宮-縫（utse）合胞體在L4中期至晚期階段形成了體細胞生殖腺與皮下縫細胞之間的關鍵物理連接。這些解剖學和發育學的見解為VSPs生物合成的發現提供了背景。utse細胞連接在L4階段的建立與VSPs生產的開始時間相吻合，提出了體細胞生殖腺信號傳導至縫細胞——通過這種物理連接介導——可能調控信息素合成的可能性。雖然VSPs不在生殖腺本身產生，但生殖腺與縫細胞（通過utse細胞）的結構整合可能提供發育線索來調節縫細胞中的OAC基因活性。未來的工作可以評估破壞utse