《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：Regulation of e-cadherin by mixed lineage kinase (MLK3) mediates cell adhesion in ovarian cancer spheroids
編輯推薦：
本研究針對卵巢癌轉移過程中E-鈣黏蛋白介導的細胞黏附調控機制不明確的問題，首次揭示混合譜系激酶3(MLK3)通過直接相互作用并磷酸化E-鈣黏蛋白，正向調控其蛋白穩定性，從而促進卵巢癌細胞黏附和球形聚集體形成。這一發現為理解卵巢癌腹膜轉移提供了新視角，為靶向MLK3-E-cadherin軸的治療策略奠定了理論基礎。
卵巢癌作為婦科惡性腫瘤中的"隱形殺手"，其獨特的轉移方式一直是研究重點。與大多數通過血管轉移的癌癥不同，卵巢癌細胞更傾向于脫落后在腹水中形成多細胞球形聚集體，這些球形聚集體通過腹膜液擴散并附著在腹腔器官表面，導致腹膜轉移。在這一過程中，細胞間的黏附作用尤為關鍵，而E-鈣黏蛋白(E-cadherin)作為上皮細胞黏著連接的核心蛋白，其調控機制尚未完全闡明。
以往研究表明，混合譜系激酶3(MLK3)作為一種絲氨酸/蘇氨酸MAP3K激酶，在多種癌癥中調控細胞增殖、遷移和侵襲。但在卵巢癌中，MLK3是否以及如何參與細胞黏附過程的調控仍不明確。這一科學問題的解答，對于深入理解卵巢癌轉移機制具有重要意義。
研究人員通過一系列精巧的實驗設計，首次揭示了MLK3在卵巢癌球形聚集體形成中的關鍵作用。他們發現抑制MLK3的表達或激酶活性會顯著破壞SKOV3、TOV112D和OVCAR3三種卵巢癌細胞系的球形聚集體形成能力，而這一現象可通過過表達E-鈣黏蛋白得到挽救。進一步的機制研究表明，MLK3與E-鈣黏蛋白存在直接相互作用，并能磷酸化E-鈣黏蛋白，從而增強其蛋白穩定性。
該研究發表于《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》，為了開展這項研究，團隊主要運用了基因沉默技術(MLK3 siRNA和β-連環蛋白siRNA)、激酶活性抑制(CEP1347處理)、蛋白質相互作用分析(免疫共沉淀和體外結合實驗)、蛋白質穩定性評估(環己酰亞胺追蹤實驗)、體外激酶分析、免疫熒光定位以及球形聚集體形成實驗等關鍵技術方法。
3.1. MLK3是卵巢癌球形聚集體形成所必需的
研究人員通過siRNA敲低MLK3或使用MLK3激酶抑制劑CEP1347處理三種卵巢癌細胞系(OVCAR3、SKOV3、TOV112D)，發現均能顯著抑制球形聚集體的形成，表明MLK3激酶活性對細胞-細胞黏附和卵巢癌球形聚集體形成至關重要。
3.2. MLK3調控卵巢癌細胞中E-鈣黏蛋白水平
實驗顯示，MLK3 siRNA敲低顯著降低了SKOV3和TOV112D細胞中的E-鈣黏蛋白蛋白水平，但不對其基因表達產生明顯影響，表明MLK3在蛋白質水平上正向調控E-鈣黏蛋白。
3.3. MLK3穩定卵巢癌細胞中的E-鈣黏蛋白蛋白
通過環己酰亞胺(CHX)追蹤實驗發現，MLK3敲低加速了E-鈣黏蛋白蛋白的降解速率。在SKOV3細胞中，MLK3敲低后24小時E-鈣黏蛋白殘留量不足33%，而對照組仍保留約73%，證明MLK3表達是E-鈣黏蛋白穩定性所必需的。
3.4. E-鈣黏蛋白和MLK3在卵巢癌細胞中相關聯
免疫共沉淀實驗證實內源性MLK3和E-鈣黏蛋白在三種卵巢癌細胞系中存在相互作用，體外結合實驗進一步證明兩種蛋白可直接結合。免疫熒光顯示MLK3與E-鈣黏蛋白在細胞-細胞接觸區域的質膜上共定位。
3.5. β-連環蛋白不是MLK3與E-鈣黏蛋白結合所必需的
即使敲低β-連環蛋白，MLK3與E-鈣黏蛋白的相互作用仍得以維持，且MLK3在細胞連接處的定位不受影響，表明二者的結合不依賴于β-連環蛋白。
3.6. MLK3激酶活性對其調控E-鈣黏蛋白是必需的
CEP1347抑制MLK3激酶活性后，三種細胞系中E-鈣黏蛋白水平均顯著降低。體外激酶實驗進一步證實野生型MLK3可直接磷酸化E-鈣黏蛋白，而激酶死亡型則無此功能。
3.7. E-鈣黏蛋白過表達可挽救MLK3敲低或激酶抑制導致的球形聚集體形成缺陷
在MLK3功能受損的細胞中過表達E-鈣黏蛋白，能幾乎完全恢復球形聚集體的形成能力，證明MLK3通過調控E-鈣黏蛋白介導細胞黏附。
研究結論與討論部分強調，這項工作揭示了MLK3在調控E-鈣黏蛋白穩定性方面的新功能，為理解卵巢癌球形聚集體形成的分子機制提供了重要見解。MLK3與E-鈣黏蛋白的直接相互作用以及MLK3對E-鈣黏蛋白的磷酸化修飾，是維持細胞-細胞黏附的關鍵環節。值得注意的是，這種相互作用不依賴于β-連環蛋白，表明MLK3可能通過不同于經典途徑的機制調控E-鈣黏蛋白功能。
從進化角度而言，MLK3在細胞黏附中的作用具有保守性。果蠅MLK同源基因slpr缺失會導致胚胎背閉合完全失敗，而MLK3基因敲除小鼠也表現出沿背中線的閉合缺陷，這與本研究發現的MLK3在卵巢上皮細胞黏附中的作用相一致。
在卵巢癌進展過程中，MLK3可能發揮著雙重作用：一方面通過穩定E-鈣黏蛋白促進球形聚集體形成，另一方面通過調控基質金屬蛋白酶(MMPs)表達促進侵襲。這種雙重功能使MLK3成為卵巢癌治療的潛在靶點——抑制MLK3既可破壞球形聚集體形成，又能阻斷細胞侵襲能力。
該研究的創新性在于首次建立了MLK3-E-鈣黏蛋白-細胞黏附-球形聚集體形成這一信號軸，為卵巢癌腹膜轉移的防治提供了新的理論依據和潛在治療靶標。未來針對MLK3調控E-鈣黏蛋白具體分子機制的深入研究，可能為卵巢癌治療策略開發開辟新的方向。
