《Biomedicine & Pharmacotherapy》：Controlled release of hypoxic exosomes from PLGA microspheres attenuates IVDD progression through activating PPAR-γ and suppressing oxidative stress-mediated NPCs senescence
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本研究針對椎間盤退變（IVDD）中髓核細(xì)胞（NPCs）衰老及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）降解的難題，開發(fā)了聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）微球負(fù)載缺氧預(yù)處理間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體（H-Exos）的緩釋系統(tǒng)。研究證實(shí)，PLGA@H-Exos可持續(xù)釋放超過4周，通過激活PPAR-γ信號通路，顯著降低SA-β-gal陽性率59.8%，提升Col II和ACAN表達(dá)30.7%和25.5%，有效延緩IVDD進(jìn)展。該策略為解決外泌體體內(nèi)快速清除、靶向性差提供了創(chuàng)新性遞送方案，為椎間盤退變的臨床治療提供了潛在轉(zhuǎn)化價(jià)值。
腰痛是全球范圍內(nèi)困擾約80%成年人的健康問題，其首要病因是椎間盤退變（Intervertebral Disc Degeneration, IVDD）。隨著人口老齡化加劇，IVDD導(dǎo)致的疼痛、功能障礙和社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)日益凸顯。椎間盤是一個(gè)無血管組織，其核心髓核細(xì)胞（Nucleus Pulposus Cells, NPCs）在退變過程中面臨氧化應(yīng)激、衰老和細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix, ECM）降解等多重打擊。當(dāng)前臨床治療以緩解癥狀為主，無法逆轉(zhuǎn)退變進(jìn)程，因此開發(fā)能夠靶向調(diào)控NPCs生物學(xué)行為、延緩ECM降解的創(chuàng)新療法成為迫切需求。
間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）因其多向分化潛能和旁分泌作用被視為再生醫(yī)學(xué)的理想工具。其中，MSCs來源的外泌體（Exosomes）作為天然納米囊泡，攜帶蛋白質(zhì)、核酸等活性物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能、促進(jìn)組織修復(fù)的潛力。然而，外泌體在體內(nèi)易被快速清除、半衰期短，且在椎間盤高滲壓、高流體動力學(xué)環(huán)境中難以富集，嚴(yán)重限制了其療效。此外，常規(guī)常氧條件下培養(yǎng)MSCs獲得的外泌體（Exos）與其體內(nèi)生理性缺氧微環(huán)境（1%~5% O2）存在差異，可能導(dǎo)致修復(fù)能力減弱。研究表明，缺氧預(yù)處理能夠優(yōu)化外泌體的 cargo 組成，增強(qiáng)其適應(yīng)性修復(fù)功能，但如何實(shí)現(xiàn)外泌體在病變部位的長期、高效滯留仍是挑戰(zhàn)。
為此，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院骨科研究所的張迪教授團(tuán)隊(duì)在《Biomedicine 》上發(fā)表研究，設(shè)計(jì)了一種基于聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA）微球的緩釋系統(tǒng)，用于負(fù)載缺氧預(yù)處理外泌體（H-Exos），并系統(tǒng)評價(jià)了其在延緩IVDD中的作用及機(jī)制。
研究團(tuán)隊(duì)采用雙乳液溶劑蒸發(fā)法制備了PLGA@Exos和PLGA@H-Exos微球，通過掃描電鏡、粒徑分析、CCK-8實(shí)驗(yàn)、活死染色等表征了微球的形貌、生物相容性及釋放動力學(xué)；通過超速離心法分離常氧及缺氧預(yù)處理BMSCs來源的外泌體，并利用透射電鏡、納米顆粒追蹤分析、Western blot進(jìn)行鑒定；通過H2O2誘導(dǎo)建立NPCs衰老模型，采用SA-β-gal染色、Edu染色、Transwell、劃痕實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR、Western blot、免疫熒光等技術(shù)評估外泌體對細(xì)胞增殖、遷移、衰老、凋亡、ECM代謝的影響；利用大鼠尾椎針刺法構(gòu)建IVDD模型，通過X射線、MRI、組織切片染色（HE、Safranin O/Fast Green）、免疫組化等評價(jià)治療效果；通過RNA測序、GO/KEGG富集分析、GSEA探索潛在分子機(jī)制，并利用抑制劑（GW9662）和激動劑（DMOG）進(jìn)行功能驗(yàn)證。
3.1. PLGA微球與外泌體的表征
PLGA微球呈球形，粒徑主要分布在15-25 μm，具備高包封效率（>90%）和良好的生物相容性。缺氧預(yù)處理顯著提升BMSCs中HIF-1α表達(dá)，并使H-Exos的蛋白含量高于Exos。釋放實(shí)驗(yàn)顯示PLGA@H-Exos具備持續(xù)釋放超過4周的能力，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)其能延長外泌體在椎間盤內(nèi)的滯留時(shí)間。
3.2. PLGA微球釋放液對NPCs活性的影響
PLGA@H-Exos顯著促進(jìn)NPCs增殖（Edu、CCK-8）、遷移（Transwell、劃痕）及細(xì)胞周期S期比例，并通過GSEA驗(yàn)證其激活細(xì)胞周期通路。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示PLGA@H-Exos組Ki67與Col II共定位增強(qiáng)，表明增殖細(xì)胞具備合成ECM能力。
3.3. PLGA@H-Exos減輕NPCs凋亡與氧化應(yīng)激
H-Exos有效降低H2O2誘導(dǎo)的ROS、MDA水平，提升SOD活性，抑制凋亡（TUNEL、流式細(xì)胞術(shù)、Cleaved Caspase-3），并上調(diào)BCL-2表達(dá)，體現(xiàn)其抗氧化和抗凋亡雙重作用。
3.4. PLGA@H-Exos延緩NPCs衰老
SA-β-gal染色及p16、p21、p53表達(dá)分析顯示，PLGA@H-Exos顯著抑制衰老相關(guān)表型，降低炎癥因子TNF-α、IL-1β水平，逆轉(zhuǎn)SASP介導(dǎo)的細(xì)胞功能衰退。
3.5. PLGA@H-Exos對ECM代謝的調(diào)控
qPCR及免疫熒光顯示PLGA@H-Exos上調(diào)Col II、ACAN合成，下調(diào)MMP13、ADAMTs-5降解基因，恢復(fù)ECM合成-降解平衡。組織染色進(jìn)一步驗(yàn)證其在體內(nèi)促進(jìn)GAG保留、維持椎間盤結(jié)構(gòu)完整性的作用。
3.6. PLGA@H-Exos在大鼠IVDD模型中的治療效果
影像學(xué)及組織學(xué)評價(jià)表明，PLGA@H-Exos能顯著維持椎間盤高度指數(shù)（DHI）、改善Pfirrmann分級，抑制組織退變，且療效持續(xù)至12周，優(yōu)于PLGA@Exos組。
3.7. PPAR-γ是PLGA@H-Exos治療IVDD的關(guān)鍵靶點(diǎn)
轉(zhuǎn)錄組測序提示PPAR信號通路顯著富集。Western blot、qPCR、免疫熒光證實(shí)PLGA@H-Exos通過上調(diào)PPAR-γ表達(dá)抑制P53介導(dǎo)的衰老，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)一致驗(yàn)證該機(jī)制。
3.8. PLGA@H-Exos通過HIF-1α增強(qiáng)PPAR-γ表達(dá)
功能實(shí)驗(yàn)顯示H-Exos攜帶更高水平HIF-1α，其激活PPAR-γ的作用可被HIF-1α抑制劑（PX-478）阻斷，而HIF-1α激動劑（DMOG）處理進(jìn)一步強(qiáng)化該效應(yīng)，證實(shí)“HIF-1α→PPAR-γ”信號軸的存在。
3.9. PPAR-γ抑制加劇NPCs衰老
使用PPAR-γ抑制劑GW9662可逆轉(zhuǎn)PLGA@H-Exos對衰老、氧化應(yīng)激、ECM合成的保護(hù)作用，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證PPAR-γ在介導(dǎo)療效中的核心地位。
本研究系統(tǒng)闡明了PLGA@H-Exos緩釋系統(tǒng)通過“HIF-1α–PPAR-γ”軸調(diào)控NPCs衰老、氧化應(yīng)激及ECM代謝，有效延緩IVDD進(jìn)程的分子機(jī)制。該策略不僅解決了外泌體體內(nèi)遞送的瓶頸問題，還通過缺氧預(yù)處理優(yōu)化了外泌體的功能活性，為椎間盤退變的靶向治療提供了新思路。未來研究可進(jìn)一步優(yōu)化微球制備工藝、探索臨床轉(zhuǎn)化路徑，推動該技術(shù)向臨床應(yīng)用邁進(jìn)。
