全球氣候變化和人口增長對糧食安全構成嚴峻挑戰，迫切需要開發可持續的作物育種新策略。傳統育種方法存在精度低、周期長等局限，而CRISPR/Cas系統的出現為植物基因組精準修飾帶來了革命性工具。最初的研究集中于引入雙鏈斷裂（DSB）并通過易錯的非同源末端連接（NHEJ）通路產生小片段插入或缺失（indel）。近年來，技術發展已實現從單核苷酸編輯到大規模染色體重排的跨越，為作物改良開辟了全新維度。

在植物細胞中，DSB主要通過NHEJ通路修復，這給實現精確、無疤痕的大片段序列整合帶來挑戰。為克服此限制，研究人員開發了多種新策略。

一種策略是優化利用NHEJ通路。例如，將化學修飾的供體DNA（如具有硫代磷酸酯末端的雙鏈寡核苷酸dsODN）與CRISPR/SpCas9結合，可在水稻中實現高達2 kb的靶向插入，效率達25%。進一步優化的定向寡核苷酸靶向插入（DOTI）技術，通過匹配Cas9產生的5‘突出端，在_{Setaria viridis}和水稻中實現了無縫插入，效率高達60.9%。

同源定向修復（HDR）是另一種精確整合途徑，但其在植物中的應用受限于低效的同源重組。近期研究通過將5’核酸酶（如皰疹病毒UL12、噬菌體T7）與Cas9或LbCas12a融合，顯著提升了HDR效率。在_{Nicotiana benthamiana}中，Cas9-UL12融合使HDR頻率提升高達38倍；在擬南芥中提升10倍；在小麥中成功獲得了可穩定遺傳的超過2 kb的敲入事件。

除了依賴DSB的策略，新興的DSB-free系統如逆轉錄酶（RT）、重組酶或轉座酶介導的系統，能減少脫靶效應并提高插入效率和精度。Prime editing（PE）是一種RT介導的編輯技術，通過pegRNA將編碼的序列變化整合到基因組DNA中。雖然PE在植物細胞中效率有限，但通過工程化改造（如工程化植物Prime編輯器ePPE），其編輯效率已得到提升。更重要的是，PE的高精度特性可用于安裝位點特異性重組酶（SSR）的識別序列，從而介導更大片段DNA的靶向整合。例如，PASTE系統將Cas9切口酶與RT及絲氨酸整合酶融合，可在人類細胞中實現高達36 kb的DNA片段整合。在植物中，PrimeRoot系統結合工程化PE與優化的Cre和FLP重組酶，在水稻和玉米中實現了高達11.1 kb的DNA高效整合。近期開發的Programmable Chromosome Engineering（PCE）系統則利用PE插入優化的Cre-_Lox重組位點，并通過AI輔助設計的Cre重組酶介導靶向基因組重組，在水稻、玉米和小麥原生質體中實現了高達18.8 kb的精確插入，效率優于PrimeRoot。

CRISPR/Cas相關轉座子（CASTs）是另一類強大工具，它將RNA引導的DNA識別與轉座酶介導的整合相結合。在細菌中，I-F型CASTs可實現高達10.1 kb的 cargo DNA整合。通過進化改造獲得的evoCAST系統在人類細胞中顯示出200倍以上的活性提升，可整合超過10 kb的DNA片段。在植物中，受CASTs啟發開發的轉座酶輔助靶位點整合（TATSI）系統，利用水稻_Pong轉座子 machinery，在擬南芥和大豆中實現了序列特異性插入。

最近，IS110插入序列家族中的橋RNA（bridge RNA）系統進一步擴展了核酸引導工具庫。這些“剪切-粘貼”元件通過一種結構化的非編碼橋RNA指導序列特異性重組，其靶點和供體識別環可獨立重編程，從而介導DNA的插入、切除或倒位。該系統已在_{E. coli}中得到驗證，并在人類細胞中成功誘導了高達0.93 Mb的DNA倒位和缺失，顯示出介導復雜基因組重排的巨大潛力。

通過在一條染色體上誘導兩個DSB，可以產生精確的缺失、重復或倒位。倒位尤其有助于植物育種，因為它能控制遺傳重組，從而破壞或穩定等位基因組合。研究表明，擬南芥中著絲粒周圍異染色質序列倒位至常染色質區域，對后代的表觀遺傳狀態和基因表達影響甚微。

CRISPR/Cas方法已在多種植物中實現靶向缺失。在擬南芥中，利用SpCas9成功移除了高達684 kb的同線性區塊，包含多達60個基因和112個轉座元件，部分植株表現出明顯表型和廣泛的轉錄組變化，顯示了大規模染色體缺失在基因組精簡和等位基因替換中的應用潛力。

除了多重CRISPR策略，雙Prime editing（DualPE）系統能夠以高精度實現大規模缺失、基因替換和倒位。DualPE使用兩個位于靶DNA片段兩側的工程化pegRNA，產生互補的3‘突出端用于缺失或倒位，或產生包含所需序列變化的部分互補突出端用于替換。在小麥中，DualPE介導了高達2 Mb的缺失、258 kb的替換和205 kb的倒位，效率高達51%。在_{N. benthamiana}和番茄中，大片段編輯效率可達72%，使其成為大規模染色體工程和精準作物改良的有效工具。

雖然DualPE適用于精確序列修改，但兆堿基級的倒位通常可通過標準CRISPR/Cas方法更高效地實現。例如，在擬南芥中成功倒位了3.6 Mb的基因組片段，通過交換_{FLOWERING LOCUS T}和_HTA3的啟動子，改變了基因表達模式。

將誘導兩個DSB的策略應用于不同染色體，可產生相互易位，從而打破遺傳連鎖。在擬南芥中，誘導染色體I和II或I和IV之間高達1 Mb的相互易位，植株表現出野生型形態、微小且分散的轉錄變化、未改變的組蛋白標記譜和跨代穩定的端粒長度，顯示了擬南芥對大規模染色體重構的基因組和表型穩健性。

最近，CRISPR/Cas介導的易位被成功用于融合獨立染色體，將擬南芥的核型從10條染色體減少到8條。通過在亞著絲粒和亞端粒位點引入斷裂，將3號染色體的整條臂融合到1號染色體或重新分配到1號和5號染色體上。盡管核型顯著減少，這些植株仍表現出野生型表型和顯著的轉錄組穩定性。然而，與野生型雜交后育性降低，表明定向染色體融合不僅能重塑重組格局，還可通過重新定義連鎖群和建立與野生近緣種的生殖隔離來提供新的育種策略。通過臂轉移產生的微小染色體在后代中僅被短暫檢測到，可能因其缺乏必需基因，表明穩定遺傳的最小要求尚未完全明確。

與染色體融合減少染色體數目相對應，通過_{de novo}著絲粒 seeding 可實現染色體數目的增加。在玉米中，通過將LacI融合的CENH3衍生物錨定到染色體臂上的LacO陣列，成功重建了功能性著絲粒。近期的一項研究利用LexA–CENH3融合蛋白將天然CENH3招募到染色體臂上的LexO重復陣列，誘導雙著絲粒染色體隨機斷裂，形成可自我維持、可遺傳的新染色體。由此獲得的具有22條染色體（而非典型的20條）的品系表現出正常的生長、繁殖和表型。結合CRISPR/Cas工程，這種錨定策略為誘導靶向染色體斷裂、實現精確核型重構和_{de novo}染色體構建提供了強大手段。

由此產生的額外染色體為性狀疊加提供了可擴展的基因組空間。工程化微小染色體和新染色體凸顯了創建適用于高容量應用的合成染色體平臺（如植物人工染色體PAC系統）的日益可行性。PAC可作為模塊化載體，用于安裝大型基因組片段和協調多基因性狀或整個生物合成途徑，同時將這些組裝體作為重組隔離、可遺傳的單元進行維持。特別是在基因組冗余的多倍體作物中，合成染色體可提供具有明確拷貝數和可預測遺傳性的正交整合位點。

盡管染色體尺度工程進展迅速，但其實際應用仍受限于轉化和DNA遞送方面的挑戰，這阻礙了大多基因型中大DNA片段的高效導入。大載荷的精確、無標記整合同樣受到位點特異性效率低的限制。不過，編輯器性能、供體設計和遞送方法的持續改進正在不斷擴大可行的插入容量。隨著基因型適應性遞送平臺和靶向整合技術的進步，這些瓶頸有望逐步克服，從而拓寬染色體工程在植物育種中的效用。

CRISPR/Cas的出現將植物基因組工程從單基因操作擴展到染色體尺度的精準干預。大片段插入允許將復雜性狀直接引入天然染色體。CRISPR/Cas介導的缺失、倒位和易位為重構染色體和控制基因劑量提供了工具，大規模缺失還可應用于多倍體的染色體精簡。這些方法為模擬進化過程、探索染色體長度極限以及產生人工生殖隔離開辟了可能性。隨著靶向染色體裂變和融合的最新突破，核型尺度的重編程也已觸手可及。這些進展共同指向一個植物育種的新時代，即在染色體水平進行操作，將精準編輯與合成染色體平臺相結合，以創造具有韌性的作物和新的遺傳多樣性。