組學分析揭示了酵母細胞自絮凝表型及其耐受壓力的機制，從而實現穩健的生產
《Metabolic Engineering》：Omics analyses decoding mechanisms underlying the self-flocculating phenotype of yeast cells and stress tolerance for robust production
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時間：2026年01月09日
來源：Metabolic Engineering 6.8
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通過基因組、轉錄組和代謝網絡多組學分析，揭示了自凝聚酵母SPSC01的基因組變異特征及自凝聚與乙醇耐受性關聯機制。研究鑒定出25個父代缺失的獨特基因和13個功能未知的候選基因，發現FLO基因簇拷貝數增加和調控元件突變是自凝聚的關鍵，同時鑒定出含鋅指結構的G12蛋白顯著提升乙醇產率，并解析了ergosterol、谷胱甘肽等代謝物介導的耐受機制。
張雪|戴陽|趙新青|劉晨光|王卓|白鳳武
微生物代謝國家重點實驗室，生命科學與生物技術學院，生物-X研究所，教育部發育與神經精神疾病遺傳學重點實驗室，上海交通大學，上海，200240，中國
摘要
通過原生質融合技術，我們開發出一種獨特的自絮凝酵母菌株SPSC01，用于生產高產量的燃料乙醇。在本研究中，我們對SPSC01進行了比較性多組學分析，以闡明其自絮凝表型及其相關的耐受性機制，這是工業生產中最為理想的特性。利用兩種先進的第三代測序技術，我們成功完成了SPSC01及其親本菌株的高質量、染色體級別的基因組組裝。通過全面的基因組分析，我們發現了25個在親本菌株中缺失的獨特基因，以及13個功能未知的新基因。酵母細胞的自絮凝現象是由基因變異的拷貝數增加以及FLO基因的顯著上調轉錄所驅動的。cis和trans調控元件中的突變共同促進了FLO1及其衍生基因的持續表達，這是形成自絮凝表型的前提。值得注意的是，我們發現了一種含有鋅指結構域的新小蛋白G12，其過表達顯著提高了工程酵母菌株的乙醇產量。此外，麥角甾醇、谷胱甘肽、氨基酸和甘油磷脂代謝途徑的改變有助于提高對乙醇以及木質纖維素生物質預處理過程中產生的主要抑制劑乙酸和糠醛的耐受性。這些進展為通過合理設計來改造酵母細胞工廠提供了策略，以實現高產量和高生產力的生物燃料和生物基化學品的生產，特別是對于木質纖維素生物質的生物精煉，以促進可持續的社會經濟發展。
引言
與單獨的微小細胞相比，微生物細胞自絮凝形成適當大小的絮凝體可以增強生產穩定性（Kahar等人，2022年）。一方面，細胞絮凝體可以從大量培養/發酵液中沉淀出來，因此無需離心即可方便地回收，從而節省了離心機的資本投入和運行離心機所需的能耗，這一方法在啤酒釀造中已有悠久的歷史（Vidgren和Londesborough，2011年），最近也被用于從稀釋培養液中收獲微藻作為生物精煉的原料，以生產生物燃料和其他生物基產品（Kumar和Bharadvaja，2024年；Singh等人，2024年；Spain和Funk，2024年）。另一方面，細胞絮凝體對抑制劑具有更強的耐受性，這在工業生產中一直備受關注，因為可以節省下游過程的成本，例如在高重力（HG）和超高重力（VHG）乙醇發酵中可以減少乙醇蒸餾的能耗，最重要的是減少廢液的排放，從而進一步節省多級蒸發系統用于干燥廢液的能耗（Puligundla等人，2019年；Zhang等人，2021年）。
木質纖維素生物質的生物精煉是石油精煉的替代方案，用于生產燃料和化學品，但由于碳排放和許多其他污染物的釋放，這些過程面臨可持續性的挑戰（Banerjee等人，2024年；Wagh等人，2024年）。然而，自然進化使得纖維素、半纖維素和木質素（木質纖維素生物質的主要成分）通過碳水化合物和芳香木質素之間的相互作用緊密結合在一起，從而增強了植物的生長和發育（Kirui等人，2022年；Melati等人，2019年）。因此，需要對纖維素和半纖維素進行預處理，使其釋放并通過酶解轉化為單糖（主要是葡萄糖和木糖），作為微生物發酵的原料來生產目標產品（Chakraborty等人，2024年），但在這一過程中不可避免地會產生包括乙酸、糠醛和酚類化合物在內的抑制劑（J?nsson和Martín，2016年）。
盡管已經開發了包括物理、化學和微生物解毒在內的多種技術，但沒有一種技術在經濟效益上具有競爭力，能夠生產像生物燃料和生物基化學品這樣的大宗商品（Chong等人，2025年；Covarrubias-García和Arriaga，2022年；Ujor和Okonkwo，2022年）。毫無疑問，改造具有耐受性的細胞工廠（特別是多重耐受性的細胞工廠）是更優的選擇（Long等人，2025年；Lam等人，2021年），這已經通過釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae進行了探索，但為此目的迫切需要應激響應的遺傳元件。
S. cerevisiae已被開發為可進行工程改造的細胞工廠底盤（Hong和Nielsen，2012年）。當S. cerevisiae被工程改造以共發酵C5和C6糖類時，它可以用來生產乙醇和基于木質纖維素水解物的化學品（Li等人，2025年；Zhang等人，2025年）。我們之前通過原生質融合技術，將非絮凝的S. cerevisiae K2（一種優秀的工業乙醇發酵菌株）和自絮凝能力較弱的裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe（需要通過多代培養篩選作為親本菌株）結合起來，開發出了自絮凝酵母菌株SPSC01（Li等人，2012年；Zhao和Bai，2009年）。因此，我們推測原生質融合事件可能在SPSC01的基因和/或蛋白質中產生了突變，使其不僅具有自絮凝表型，還具有耐受性。
在本研究中，我們利用HiFi和ONT測序技術獲得了SPSC01及其親本菌株的無間隙、染色體級別的基因組序列，并使用三種方法對其完整基因組進行了注釋：基于參考蛋白序列的方法、ab initio方法和基于RNA的方法。隨后進行了轉錄組分析，以表征SPSC01的獨特乙醇響應。此外，基于轉錄組的基因組規模代謝網絡模型（GEM）研究揭示了SPSC01在代謝通量模式上的重要變化。結果，我們在基因組突變、轉錄調控和代謝變化方面發現了多層次的證據，這些因素共同促進了SPSC01的自絮凝和耐受性表型。
這種系統的計算和實驗方法為揭示基因型-表型關系提供了策略，通過代謝工程和其他合理的設計策略來改造微生物細胞工廠，以實現高效生產。
部分摘要
酵母菌株、培養基和生長條件
S. cerevisiae菌株S288C（ATCC 204508）和S. cerevisiae CICC-1445/K2（SC）分別來自美國典型培養物收藏中心（ATCC）和中國工業培養物收藏中心（CICC）。S. pombe FLO-DUT（SP）和SPSC01由我們的實驗室提供，可根據研究需求提供。SC具有出色的乙醇生產性能，在中國工業乙醇生產中有著悠久的歷史。SPSC01是這兩種親本菌株的融合體
SPSC01的自絮凝表型增強了其耐受性
在含有100 g/L葡萄糖、3 g/L酵母提取物和4 g/L蛋白胨的培養基中，分別添加了10%（v/v）的乙醇抑制劑、5 g/L的乙酸抑制劑和4 g/L的糠醛抑制劑，然后使用SPSC01、SC和SP進行乙醇發酵。如圖1所示，在所有條件下，SC消耗葡萄糖的速度都比SP快，并且產生的乙醇也更多，但SPSC的表現優于SC。因此，我們量化了SPSC01和SC在乙醇產量方面的比較
討論
借助先進的長讀長測序技術，我們獲得了SPSC01的高質量、無間隙的染色體級別基因組。SPSC01與其親本菌株的比較顯示，SPSC01在基因上與SC更為接近，只有少數同源片段來自SP；然而與傳統S. cerevisiae不同，SPSC01的兩個染色體1發生了重組，而染色體6發生了融合，這些變化可能是由FLO基因的表達所介導的。
在基因水平上，鑒定出
結論
通過全面的多組學比較，我們揭示了SPSC01自絮凝現象及其相關耐受性的機制。新的FLO基因，以及隨機插入FLO1上游的gag-pol基因所引起的獨特基因組擾動，共同促成了SPSC01的自絮凝現象。此外，我們還發現了13種新的蛋白質，其中包括顯著提高乙醇產量的G12蛋白。基于轉錄組的GEM模型揭示了
數據訪問
我們在本研究中生成的原始DNA和RNA測序數據及基因組已存儲在NCBI BioProject中，分別對應SPSC01、SC和SP的訪問編號為PRJNA1075684、PRJNA792931和PRJNA792932。如需獲取代謝組數據，請聯系相應的作者。
CRediT作者貢獻聲明
白鳳武：撰寫 – 審稿與編輯，監督。王卓：撰寫 – 審稿與編輯，監督。劉晨光：監督。趙新青：資源支持。戴陽：軟件與方法學研究。張雪：初稿撰寫，實驗研究未引用的參考文獻
Juarez-Contreras等人，2023年；Wang等人，2023年。
致謝
本研究的資金支持來自中國國家重點研發計劃（2024YFA0916600）、上海市科技重大項目、上海市科技創新行動計劃（24JS2840400）以及浙江省多組學與分子酶學重點實驗室（2024E10101）。
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