《Analytical Chemistry》：Orthogonal Investigation at Single-Particle and Ensemble Levels Uncovers Lipoprotein-Extracellular Vesicle Binding
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本研究通過構建正交分析技術組合（熒光交叉關聯光譜FCCS、超分辨顯微鏡SRM、流式細胞術FC、單分子陣列Simoa），首次在多尺度層面系統揭示人紅細胞源細胞外囊泡（REVs）與不同類別脂蛋白（LPs）在緩沖液和血漿環境中的結合特性。研究發現脂蛋白與細胞外囊泡的結合具有類別特異性和環境依賴性，親和力范圍為10 nM至1 μM，且在血漿蛋白存在下高達100%的REVs與高密度脂蛋白（HDL）發生相互作用。該工作為生理條件下細胞外納米顆粒介觀相互作用研究建立了方法學框架，對理解EV-LP復合物的生物學功能及推動囊泡藥物遞送系統設計具有重要意義。
引言背景
生物流體是納米結構體系，其中細胞外納米顆粒（ENPs）如細胞外囊泡（EVs）和脂蛋白（LPs）通過表面相互作用形成動態網絡。脂蛋白作為載脂微粒，與EVs的互作可能影響后者的功能特性及體內命運。傳統上LPs常被視為EV分離中的污染物，但近期研究表明二者存在物理結合、物質交換及融合等行為，尤其在血漿中LPs數量遠超EVs（高達105:1），促使互作發生。本研究選取理化性質均一、易規模化生產的紅細胞源EVs（REVs）為模型，結合高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和極低密度脂蛋白（VLDL），在緩沖液（t1）及模擬生理環境（t2，添加去納米顆粒血漿）中系統解析EV-LP結合機制。
材料與方法
REVs通過鈣離子載體A23187誘導紅細胞囊泡化并經超速離心純化，脂蛋白為商品化純品。采用動態光散射（DLS）表征粒徑和ζ電位，蛋白質標記通過Atto 633 NHS酯（REVs）和Atto 488 DPPE（LPs）實現。正交技術包括：
- 1.
超分辨顯微鏡（dSTORM）：通過DBSCAN算法聚類定位點，分析REV-LP空間共定位；
- 2.
熒光交叉關聯光譜（FCCS）：通過交叉關聯函數（Gxy(τ)）定量溶液中動態互作比例；
- 3.
流式細胞術（FC）：利用膜感應肽（MSP）功能化磁珠捕獲EVs，檢測LP結合穩定性；
- 4.
單分子陣列（Simoa）：開發免疫異質夾心法（抗Band 3捕獲/抗ApoA1或ApoB100檢測），直接檢測未標記樣本中復合物。
結果與討論
理化表征：REVs粒徑約120 nm，HDL、LDL、VLDL分別為8 nm、15 nm、30 nm；所有顆粒均帶負電。Western blot驗證REVs表達Band 3、HDL表達ApoA1、LDL/VLDL表達ApoB100，樣本無交叉污染。
dSTORM-DBSCAN可視化：在t1/t2條件下均觀察到REV-LP共定位（圖3），約20%（HDL）至30%（LDL/VLDL）的REVs與LPs結合，血漿添加未顯著改變共定位率。
FCCS動態結合分析：
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在血漿環境中，HDL與REVs互作比例最高（ρREVs≈1.0），LDL次之（0.74），VLDL最低（0.38）；
- •
劑量效應曲線擬合Hill模型顯示：HDL結合呈正協同性（n>1），LDL符合Langmuir模型（n≈1），VLDL為負協同（n<1）；
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表觀解離常數Kd表明LDL親和力最高（Kd≈10 nM），HDL與VLDL親和力低一數量級。
FC穩定性驗證：LP結合可抵抗洗滌步驟，且高濃度LP會遮蔽REVs表面位點，抑制MSP結合，提示LP可能形成穩定“冠狀結構”。
Simoa免疫檢測：新開發 assay 在血漿背景中成功檢測到EV-LP復合物，檢測限（LOD）低于生理濃度一數量級，為復雜樣本分析提供工具。
結論與展望
EV-LP結合是普遍現象，受LP類別、環境因素（如血漿蛋白）及表面位點可及性共同調控。該互作可能影響EVs的膜可及性、細胞攝取及靶向遞送效率。本研究建立的多尺度正交分析策略為闡釋EVs的“情境依賴性身份”提供了方法論支持，未來可拓展至競爭性結合、功能調控機制及靶向遞送系統優化等研究。
