引言

次級切倫科夫誘導(dǎo)熒光成像（SCIFI）是一種新興的生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像技術(shù)。它利用放射性衰變過程中產(chǎn)生的微弱藍(lán)光加權(quán)切倫科夫發(fā)光（CL）來激發(fā)鄰近的近紅外（NIR）熒光團(tuán)，從而產(chǎn)生波長在650–1350納米、具有最佳生物組織穿透性的近紅外光發(fā)射。這種原位激發(fā)方法與受散射和衰減困擾的傳統(tǒng)外部激發(fā)技術(shù)形成鮮明對比。

SCIFI概念的發(fā)展經(jīng)歷了幾個關(guān)鍵研究階段。劉等人首次在攜帶異種移植瘤的無胸腺裸鼠中，當(dāng)共同給予[¹³¹I]NaI和量子點(diǎn)（QD655）時，演示了“輻射發(fā)光激發(fā)”。隨后，Dothager等人使用¹⁸F和⁶⁴Cu產(chǎn)生的CL激發(fā)Qtracker705，將這一現(xiàn)象描述為“切倫科夫輻射能量轉(zhuǎn)移（CRET）”。此后，Thorek等人引入了SCIFI這一術(shù)語，他們在攜帶HER2/neu陽性異種移植瘤的小鼠體內(nèi)，觀察到[⁸⁹Zr]Zr-DFO-曲妥珠單抗與QD605共定位時產(chǎn)生近紅外紅移發(fā)射。這些研究為CL介導(dǎo)的激發(fā)在生物醫(yī)學(xué)光學(xué)成像應(yīng)用（包括體內(nèi)疾病分子標(biāo)志物檢測）中的效用提供了早期證據(jù)。

先前的研究證實(shí)了硼二吡咯亞甲基（BODIPY）染料與⁸⁹Zr組合在SCIFI應(yīng)用中的適用性，盡管長時間暴露于電離輻射，仍能快速獲取（小于5分鐘）CL誘導(dǎo)的發(fā)射光譜并具有高光穩(wěn)定性。隨后，研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了[⁸⁹Zr]Zr-DFO-曲妥珠單抗-BOD665的合成和體外評估；這是一種基于抗體的新型自激發(fā)免疫SCIFI探針，對癌癥生物標(biāo)志物HER2具有高結(jié)合特異性，并能由⁸⁹Zr產(chǎn)生的CL誘導(dǎo)近紅外熒光發(fā)射。該研究還包括基于血紅蛋白灌注的瓊脂糖模型的熒光和CT成像實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與⁸⁹Zr產(chǎn)生的CL相比，⁸⁹Zr和BOD665結(jié)合后SCIFI信號的深度穿透增強(qiáng)了2.05倍。

基于這些初步發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊(duì)推進(jìn)了免疫SCIFI的臨床前開發(fā)，本文報(bào)告的研究主要旨在評估其在體內(nèi)的適用性。為此，采用了一個已建立的去分化軟骨肉瘤原位小鼠模型，該模型通過股骨內(nèi)接種過表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MT1-MMP，也稱為MMP14）的HT1080細(xì)胞產(chǎn)生，為成像驗(yàn)證提供了一個穩(wěn)健、高對比度的環(huán)境，而深入的靶點(diǎn)特異性分析計(jì)劃在未來的研究中進(jìn)行。本研究設(shè)計(jì)了一種新型抗MT1-MMP免疫SCIFI探針，其基礎(chǔ)是一種鼠源單克隆免疫球蛋白G（IgG），研究團(tuán)隊(duì)之前已通過位點(diǎn)特異性化學(xué)酶法對該抗體進(jìn)行了⁸⁹Zr和IRDye800CW修飾，用于在同一小鼠模型中進(jìn)行MT1-MMP過表達(dá)的雙模態(tài)（PET/NIRF）成像。在本研究中，該抗體以隨機(jī)方式用CL生成同位素⁸⁹Zr和CL可激活熒光團(tuán)BOD665進(jìn)行修飾。

該探針的設(shè)計(jì)原理是，⁸⁹Zr衰變產(chǎn)生的CL其光子能量轉(zhuǎn)移至抗體上連接的BOD665熒光團(tuán)，從而產(chǎn)生紅移的SCIFI發(fā)射光。將探針靜脈注射到攜帶股骨HT1080腫瘤的小鼠體內(nèi)，即可實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的次級切倫科夫誘導(dǎo)熒光成像。

結(jié)果與討論

合成與表征

首先，通過BODIPY 650/665-X-NHS酯（BOD665）與抗體內(nèi)源性賴氨酸殘基的ε-氨基形成酰胺鍵，對抗MT1-MMP免疫球蛋白（IgG）進(jìn)行隨機(jī)修飾。純化后的分離產(chǎn)率為53%，通過紫外-可見吸收測量確定標(biāo)記度（DOL）為2。連接后，BOD665的最大吸收波長（A_max）從655納米紅移至665納米，這與先前報(bào)道的抗體-熒光團(tuán)偶聯(lián)物一致。雖然CL在紫外-藍(lán)光區(qū)域最強(qiáng)，但其寬發(fā)射光譜與BODIPY染料的激發(fā)譜有足夠重疊，從而能夠?qū)崿F(xiàn)SCIFI，而由此產(chǎn)生的近紅外發(fā)射增強(qiáng)了體內(nèi)的組織穿透性。

隨后，雙功能⁸⁹Zr螯合劑p-SCN-Bn-去鐵胺（p-SCN-Bn-DFO）通過賴氨酸導(dǎo)向的硫脲形成與anti-MT1-MMP-BOD665連接，得到DFO-anti-MT1-MMP-BOD665，純化后分離產(chǎn)率為99%。基于之前對相關(guān)免疫偶聯(lián)物的研究結(jié)果，本工作中同時進(jìn)行的BODIPY和DFO生物共軛連接不太可能影響結(jié)合能力。

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析顯示，BOD665和anti-MT1-MMP的條帶在約150 kDa處共定位，表明染料已成功連接到抗體上。

放射性標(biāo)記與表征

DFO-anti-MT1-MMP-BOD665偶聯(lián)物以0.1 MBq/μg的比活度用中和后的⁸⁹Zr進(jìn)行標(biāo)記，通過放射性即時薄層色譜（radio-iTLC）測定放射標(biāo)記效率大于99%，且無需進(jìn)一步純化即可使用。SDS-PAGE分析及隨后的成像顯示，放射性核素與anti-MT1-MMP蛋白及BOD665熒光信號共定位，證實(shí)了[⁸⁹Zr]Zr-DFO-anti-MT1-MMP-BOD665免疫SCIFI探針的合成。

體內(nèi)及離體評估

將[⁸⁹Zr]Zr-DFO-anti-MT1-MMP-BOD665靜脈注射到攜帶HT1080股骨腫瘤的小鼠體內(nèi)（一種新近開發(fā)的、臨床相關(guān)的MT1-MMP陽性去分化軟骨肉瘤小鼠模型）。在注射后24、48和72小時對小鼠進(jìn)行成像，分別檢測⁸⁹Zr產(chǎn)生的切倫科夫發(fā)光（CL；激發(fā)塊，發(fā)射500納米濾光片）和SCIFI信號（激發(fā)塊，發(fā)射開放濾光片）。先前對⁸⁹Zr產(chǎn)生CL的IVIS成像顯示，在500納米發(fā)射濾光片下發(fā)射最強(qiáng)，而探針在該濾光片內(nèi)沒有發(fā)射信號，表明能量有效地從CL轉(zhuǎn)移至BOD665熒光團(tuán)。當(dāng)活鼠在開放濾光片設(shè)置下成像時，在HT1080接種的股骨區(qū)域檢測到發(fā)射信號，而對側(cè)股骨則沒有信號。這些發(fā)現(xiàn)與修飾后的IgG與MT1-MMP結(jié)合以及CL介導(dǎo)的BOD665熒光團(tuán)激發(fā)相一致，盡管確證還需要額外的特異性導(dǎo)向機(jī)制研究。

在最終成像結(jié)束后，從小鼠身上取下后肢，并使用先前實(shí)施的相同設(shè)置進(jìn)行成像。再次觀察到在500納米波長下，接種側(cè)和對側(cè)后肢均無CL信號，而在使用開放發(fā)射濾光片時，沿股骨軸線檢測到顯著的SCIFI發(fā)射。

隨后從后肢中取出股骨和周圍的肌肉組織，分別對CL（500納米）和SCIFI（開放濾光片）以及六個附加發(fā)射濾光片（600–700納米，20納米遞增）進(jìn)行成像。SCIFI發(fā)射的峰值位于620納米發(fā)射濾光片（帶寬10納米：610–630納米范圍）內(nèi)，隨后在接種的股骨中單調(diào)遞減至700納米。同時注意到對側(cè)股骨沒有CL或SCIFI發(fā)射。這些發(fā)現(xiàn)與在類似發(fā)射濾光片范圍內(nèi)對小鼠進(jìn)行的體內(nèi)成像結(jié)果一致。觀察到BOD665的發(fā)射最大值發(fā)生了明顯的偏移，這可以歸因于體內(nèi)環(huán)境比體外條件復(fù)雜得多。例如，體內(nèi)熒光團(tuán)的濃度通常低于體外環(huán)境，這是一個重要的區(qū)別，因?yàn)槿玖蠞舛纫阎獣��?dǎo)致光譜變化。此外，血紅蛋白會導(dǎo)致熒光信號的衰減和光譜畸變，尤其是在近紅外區(qū)域。腫瘤的骨內(nèi)位置為診斷于患者的肉瘤提供了一個類比模型，然而，由于與周圍軟組織相比光學(xué)特性的異質(zhì)性，骨骼的存在可能會進(jìn)一步扭曲熒光光譜。

通過伽馬計(jì)數(shù)對免疫SCIFI探針進(jìn)行生物分布分析，以每克組織注射⁸⁹Zr活性的百分比表示。總體生物分布特征與72小時注射后類似的完整IgG基放射性免疫偶聯(lián)物一致。統(tǒng)計(jì)分析顯示，[⁸⁹Zr]Zr-DFO-anti-MT1-MMP-BOD665在MT1-MMP過表達(dá)股骨中的攝取量顯著高于MT1-MMP低表達(dá)股骨。同樣，受累股骨的股骨與肌肉比率也顯著更高。此外，通過對股骨離體成像期間的SCIFI信號進(jìn)行感興趣區(qū)域（ROI）分析定量，結(jié)果證實(shí)了伽馬計(jì)數(shù)器分析的發(fā)現(xiàn)。對于對側(cè)股骨，通過熒光發(fā)射數(shù)據(jù)確定的股骨與肌肉比率明顯低于通過伽馬計(jì)數(shù)確定的相應(yīng)值，這可能是由于儀器特定的靈敏度限制和光學(xué)衰減。類似地，肝臟攝取與光學(xué)信號之間的差異反映了深部內(nèi)臟器官近紅外發(fā)射回收率差這一眾所周知的特點(diǎn)，與相對更有利的骨內(nèi)腫瘤環(huán)境形成對比。

盡管完整的IgG構(gòu)建體通過增強(qiáng)的滲透性和滯留（EPR）效應(yīng)表現(xiàn)出一定程度的基線腫瘤定位，但[⁸⁹Zr]Zr-DFO-anti-MT1-MMP-BOD665在MT1-MMP過表達(dá)股骨中的攝取量超過了在可比時間點(diǎn)通常報(bào)道的非靶向IgG的值。此外，該抗體克隆的一個密切相關(guān)的雙模態(tài)類似物（用[⁸⁹Zr]Zr-DFO和一種NIR染料修飾）保留了超過80%的免疫反應(yīng)性，并在相同的HT1080模型中證明了可被阻斷的攝取。這些觀察結(jié)果共同提供了令人信服（盡管仍是推斷性的）證據(jù)，表明原位腫瘤中的免疫SCIFI信號與MT1-MMP的結(jié)合一致。全面的生物學(xué)驗(yàn)證和體內(nèi)特異性的最終確認(rèn)將在即將進(jìn)行的、更具統(tǒng)計(jì)效力的研究中展開，該研究將結(jié)合過量抗體阻斷和在MT1-MMP缺陷腫瘤中的成像，從而補(bǔ)充本研究的方法學(xué)重點(diǎn)。

結(jié)論

在這項(xiàng)工作中，研究團(tuán)隊(duì)合成了一種雙標(biāo)記、自激發(fā)的抗體探針[⁸⁹Zr]Zr-DFO-anti-MT1-MMP-BOD665，并首次在臨床相關(guān)的小鼠肉瘤模型中演示了抗體介導(dǎo)的SCIFI在體內(nèi)條件下的應(yīng)用。從⁸⁹Zr產(chǎn)生的CL到BOD665熒光團(tuán)的光子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生了強(qiáng)大的近紅外信號，該信號無需傳統(tǒng)的外部激發(fā)源即可穿透骨骼和軟組織進(jìn)行檢測。在原位腫瘤中觀察到的攝取模式與MT1-MMP的結(jié)合一致，但本研究的主要貢獻(xiàn)在于方法學(xué)上驗(yàn)證了免疫SCIFI作為一種體內(nèi)光學(xué)成像模式的可行性。這些發(fā)現(xiàn)為未來的研究建立了一個平臺，旨在進(jìn)行全面的靶點(diǎn)特異性確認(rèn)，并將該技術(shù)擴(kuò)展到更多的生物標(biāo)志物和疾病環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)方法

通用方法

除非另有說明，試劑和消耗品均購自Fisher Scientific并按原樣使用。超純水使用Select Fusion系統(tǒng)制備，電阻率≥18.2 MΩ·cm（25°C）。紫外-可見吸收讀數(shù)在NanoDrop OneC超微量分光光度計(jì)上收集。放射性測量使用CRC-25劑量校準(zhǔn)儀或Wizard 2480伽馬計(jì)數(shù)器進(jìn)行。通過即時薄層色譜（iTLC）在iTLC-SA玻璃微纖維條上評估免疫偶聯(lián)物中的放射性標(biāo)記摻入情況。顯影后的條帶通過放射自顯影在Amersham Typhoon成像儀上可視化，并在ImageQuant軟件中進(jìn)行定量。

Anti-MT1-MMP-BOD665的制備

將四份100微克的anti-MT1-MMP抗體匯集并用0.1 M NaHCO₃（pH 8.3）稀釋。抗體溶液使用預(yù)清洗的30 kDa截留分子量的0.5 mL離心過濾器通過離心過濾進(jìn)行緩沖液交換。經(jīng)過三個循環(huán)的離心和緩沖液補(bǔ)充后，通過反轉(zhuǎn)過濾裝置并離心回收抗體，然后用0.1 M NaHCO₃（pH 8.3）將抗體濃度調(diào)整至2 mg/mL。將BODIPY 650/665-X NHS酯溶解在DMSO中制備成3 mg/mL的儲備液。將50倍摩爾過量的染料（來自DMSO儲備液）加入到抗體溶液中，反應(yīng)混合物在25°C下孵育1小時，并伴隨振蕩。

尺寸排阻色譜

粗制的anti-MT1-MMP–BOD665偶聯(lián)物使用Sephadex G-50樹脂裝填的2 mL玻璃迷你柱進(jìn)行尺寸排阻色譜純化。用無菌PBS（pH 7.2）進(jìn)行洗脫，收集100微升餾分。免疫偶聯(lián)物通常在8-12餾分中洗脫，而未反應(yīng)的染料則保留在柱上。收集的餾分通過紫外-可見吸收在280納米和665納米（BOD665的λ_max）進(jìn)行篩選，將含偶聯(lián)物的餾分匯集，并使用上述單步離心過濾進(jìn)行濃縮。

標(biāo)記度確定

純化免疫偶聯(lián)物溶液中每個抗體偶聯(lián)的BOD665染料的平均數(shù)量（DOL_BOD665）基于紫外-可見吸收光譜數(shù)據(jù)計(jì)算。計(jì)算涉及使用校正因子（CF）和抗體在10 mg/mL溶液中的百分摩爾消光系數(shù)（ε₁%）來確定抗體濃度。BOD665的摩爾消光系數(shù)（ε）通過紫外-可見吸收光譜的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定，包括未偶聯(lián)（ε₆₅₅= 84,590 M^–1cm^–1）和偶聯(lián)狀態(tài)（ε₆₆₅= 65,210 M^–1cm^–1）。

DFO連接

將p-SCN-Bn-DFO的DMSO儲備液以15倍摩爾過量加入到0.1 M NaHCO₃緩沖液（pH 8.9–9.0）中的anti-MT1-MMP–BOD665中。反應(yīng)容器用鋁箔包裹避光，并在37°C下孵育1小時，伴隨振蕩。得到的DFO-anti-MT1-MMP-BOD665偶聯(lián)物通過上述離心過濾法純化，并交換緩沖液至PBS（pH 7.2）。

放射性標(biāo)記

將[⁸⁹Zr]Zr的1 M草酸溶液通過逐步加入1 M Na₂CO₃調(diào)節(jié)至近似中性pH。取一份中和后的⁸⁹Zr溶液（約13 MBq）與DFO-anti-MT1-MMP-BOD665（130 μg）混合，目標(biāo)比活度為0.1 MBq/μg，混合物在25°C下孵育1小時，伴隨振蕩。放射標(biāo)記產(chǎn)率和放射化學(xué)純度通過放射性iTLC評估，使用50 mM EDTA（pH 5.5）作為流動相。在此條件下，放射性免疫偶聯(lián)物保留在原點(diǎn)（R_f= 0），而未螯合的⁸⁹Zr隨溶劑前沿遷移（R_f= 0.8–1.0）。

放射性SDS-PAGE

通過SDS-PAGE對[⁸⁹Zr]Zr-DFO-anti-MT1-MMP-BOD665進(jìn)行表征。抗體樣品與NuPAGE 4X LDS上樣緩沖液和去離子水混合，最終體積為10微升。樣品避光并在70°C下加熱10分鐘，伴隨振蕩。將蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品和制備好的樣品上樣到NuPAGE 3–8% Tris-乙酸酯、10孔迷你膠上，使用NuPAGE 1X Tris-乙酸酯SDS電泳緩沖液在150 V電壓下電泳1小時。電泳后，凝膠用去離子水沖洗，并用Coomassie Fluor Orange染色1小時。去除多余染液后，在成像前用去離子水最終沖洗。在Amersham Typhoon生物成像儀上進(jìn)行熒光掃描，以檢測Coomassie Fluor Orange和BOD665，然后對凝膠進(jìn)行數(shù)字⁸⁹Zr放射自顯影成像。

細(xì)胞培養(yǎng)

HT1080細(xì)胞（高表達(dá)MT1-MMP）從美國模式培養(yǎng)物集存庫（ATCC）獲得，并在補(bǔ)充有10%胎牛血清（FBS）、200 mM L-谷氨酰胺、10,000單位青霉素和10 mg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37°C、濕潤的5% CO₂環(huán)境中維持。細(xì)胞在80–90%匯合度時使用0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化傳代，每3–4天以1:15的比例傳代。從液氮儲存中復(fù)蘇細(xì)胞后，累計(jì)培養(yǎng)時間少于6個月。定期檢測細(xì)胞以確保無支原體污染。

體內(nèi)研究

所有動物程序均經(jīng)過紐卡斯?fàn)柎髮W(xué)動物福利與倫理審查機(jī)構(gòu)（AWERB）審查和批準(zhǔn)，并根據(jù)英國《動物（科學(xué)程序）法案1986》在英國內(nèi)政部項(xiàng)目許可證P74687DB5下執(zhí)行。所有涉及處理和施用⁸⁹Zr標(biāo)記材料的工作均按照機(jī)構(gòu)輻射防護(hù)程序和當(dāng)?shù)匾?guī)則進(jìn)行。給藥活度反映了臨床前抗體基PET成像中使用的典型值。雌性NOD SCID gamma（NSG）小鼠來自內(nèi)部繁殖群體，飼養(yǎng)在無特定病原體條件下的獨(dú)立通風(fēng)籠中，提供無菌墊料、自由飲水和飲食，設(shè)施內(nèi)具有10小時光暗循環(huán)，并控制溫度和濕度。每天監(jiān)測動物，每周稱重以確保其健康狀況良好。為了建立腫瘤模型，小鼠在吸入異氟烷麻醉下接受股骨內(nèi)注射HT1080細(xì)胞，并通過皮下注射卡洛芬（5 mg/kg）提供鎮(zhèn)痛。HT1080細(xì)胞經(jīng)過工程改造表達(dá)熒光素酶，以便通過生物發(fā)光成像（BLI）每周縱向監(jiān)測腫瘤生長。對于BLI，小鼠腹腔注射150 mg/kg D-熒光素，并在異氟烷麻醉下使用IVIS Spectrum測量總通量。

離體成像

在最終成像結(jié)束后，通過頸椎脫位法處死小鼠。從每只小鼠身上取下雙側(cè)后肢以及感興趣的組織。使用與獲取體內(nèi)圖像相同的設(shè)置，從腹側(cè)和背側(cè)對左右后肢進(jìn)行成像。進(jìn)一步解剖后肢，將股骨和近端大腿肌肉組織與后肢下部分離。然后使用先前描述的相同參數(shù)對股骨和相關(guān)肌肉組織進(jìn)行成像。使用Living Image軟件通過繪制相關(guān)組織的ROI來分析IVIS圖像。

離體生物分布

離體成像后，將股骨和周圍肌肉組織以及其他保留的組織放入預(yù)先稱重的計(jì)數(shù)管中并稱重。通過伽馬計(jì)數(shù)器測量每分鐘計(jì)數(shù)（CPM）來確定每個樣品中的放射性活度。CPM讀數(shù)使用已知活度樣品生成的校準(zhǔn)曲線轉(zhuǎn)換為活度單位（MBq）。活度值經(jīng)衰變校正至免疫SCIFI探針的注射時間，并歸一化到記錄的注射活度值。使用校正后的活度值和樣品質(zhì)量計(jì)算每個組織樣品的每克組織注射劑量百分比（%IA/g）。

統(tǒng)計(jì)分析

使用GraphPad Prism v9.4.1創(chuàng)建所有圖形并進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)分析。采用單尾非配對t檢驗(yàn)比較受累組織和對側(cè)組織之間的探針攝取、熒光發(fā)射和股骨與肌肉比率。數(shù)據(jù)報(bào)告為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，除非另有說明。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性用星號表示。