《Natural Products and Bioprospecting》：Revolutionizing microbial treasure troves: innovative strategies for natural products discovery
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這篇綜述系統(tǒng)闡述了微生物天然產(chǎn)物（MNP）發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域的范式變革。文章重點介紹了三種革新性策略：通過調(diào)控培養(yǎng)條件激活沉默生物合成基因簇（BGC）的“一株多產(chǎn)”（OSMAC）策略；基于基因組數(shù)據(jù)挖掘隱性代謝潛力的基因組挖掘（Genome Mining）策略，特別是CRISPR等基因編輯技術(shù)的應(yīng)用；以及利用人工智能（如機器學(xué)習(xí)ML）實現(xiàn)高效靶向發(fā)現(xiàn)的智能策略。綜述通過大量案例（2019-2025年）表明，這些策略已成功發(fā)現(xiàn)300多種結(jié)構(gòu)新穎、具有抗菌、抗癌、抗炎等活性的先導(dǎo)化合物，為應(yīng)對抗生素耐藥性等挑戰(zhàn)提供了新思路，并展望了單細(xì)胞分析、多組學(xué)整合與合成生物學(xué)相結(jié)合的未來發(fā)展方向。
引言
微生物天然產(chǎn)物是由細(xì)菌、真菌和放線菌等微生物產(chǎn)生的一類化合物，以其獨特的結(jié)構(gòu)多樣性和廣泛的生物活性而聞名，長期以來一直是藥物先導(dǎo)化合物的重要來源。據(jù)統(tǒng)計，約70%的臨床使用抗生素源于微生物。除了抗生素，微生物代謝物在免疫抑制劑（如環(huán)孢素A）、降膽固醇藥物（如洛伐他汀）以及抗癌藥物（如通過微生物發(fā)酵商業(yè)化生產(chǎn)的紫杉醇）的開發(fā)中也扮演了關(guān)鍵角色。然而，該領(lǐng)域面臨三大挑戰(zhàn)：超過90%的環(huán)境微生物無法在標(biāo)準(zhǔn)實驗室條件下培養(yǎng)；常用菌株的重復(fù)發(fā)現(xiàn)率高；以及大多數(shù)生物合成基因簇（BGC）在常規(guī)條件下處于“沉默”狀態(tài)。這些挑戰(zhàn)亟需超越傳統(tǒng)方法的范式創(chuàng)新。
創(chuàng)新策略
OSMAC策略
“一株多產(chǎn)”（OSMAC）策略是一種通過系統(tǒng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件來激活微生物中沉默BGCs的創(chuàng)新方法。其核心原則包括營養(yǎng)調(diào)控（碳源、氮源、微量元素）、物理參數(shù)調(diào)整（溫度、pH、溶氧）、生物相互作用（共培養(yǎng)）以及表觀遺傳調(diào)控（使用組蛋白去乙酰化酶抑制劑HDAC抑制劑如SAHA或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT抑制劑如5-氮雜胞苷5-azacytidine）。
培養(yǎng)方法改良
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培養(yǎng)基變化：特定培養(yǎng)基成分能精確調(diào)控代謝物結(jié)構(gòu)多樣性。例如，在添加氨基酸的GPY培養(yǎng)基中，海洋真菌Pseudallescheria boydii F44-1產(chǎn)生新型螺環(huán)雙吲哚生物堿。在含3% NaBr或KI的培養(yǎng)基中， mangrove真菌Phomopsis sp. QYM-13分別產(chǎn)生溴代和碘代細(xì)胞松弛素，其中一些對MDA-MB-435癌細(xì)胞顯示顯著細(xì)胞毒性。氮源類型（如NaNO3vs 谷氨酸鈉）可誘導(dǎo)同一真菌產(chǎn)生結(jié)構(gòu)完全不同的化合物。
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化學(xué)表觀遺傳修飾：添加表觀遺傳修飾劑能有效激活沉默代謝途徑。例如，使用5-氮雜胞苷處理內(nèi)生真菌Chaetomium globosporum，誘導(dǎo)產(chǎn)生了新型環(huán)戊烯酮和單萜吲哚生物堿，后者對水稻白葉枯病菌展示出優(yōu)異的抗菌活性，具備開發(fā)生物農(nóng)藥的潛力。SAHA和5-氮雜胞苷聯(lián)合處理深海真菌Eutypella sp.，則產(chǎn)生了17個新型倍半萜類化合物。
共培養(yǎng)
共培養(yǎng)通過模擬自然生態(tài)相互作用，有效激活沉默BGCs。
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真菌-真菌共培養(yǎng)：Penicillium屬真菌共培養(yǎng)產(chǎn)生了具有抗菌、抗腫瘤活性的新型萜類衍生物和喹啉類化合物。Aspergillus屬真菌共培養(yǎng)不僅能提高已知代謝物（如曲酸）產(chǎn)量，還能誘導(dǎo)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的化合物，如具有顯著抗白血病HL-60細(xì)胞活性的monaspin B。大型真菌（如平菇Pleurotus ostreatus）共培養(yǎng)也能產(chǎn)生新的抗菌萜類化合物。
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真菌-細(xì)菌共培養(yǎng)：例如，將海綿來源真菌Aspergillus versicolor與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）共培養(yǎng)，產(chǎn)生了新的環(huán)五肽和蒽醌類化合物。真菌Trichocladium sp.與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生了新化合物5-表-pestafolide A。
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細(xì)菌-細(xì)菌共培養(yǎng)：鏈霉菌（Streptomyces）與Pandoraea sp.共培養(yǎng)使芳香代謝物gwanakoside B的產(chǎn)量提高了100倍。Streptomyces hygroscopicus與Tsukamurella pulmonis共培養(yǎng)產(chǎn)生了具有platensimycin樣抗菌活性和腸桿菌素樣鐵螯合能力的獨特抗菌綴合物harundomycin A。
新興培養(yǎng)技術(shù)與工具
為突破純培養(yǎng)限制，出現(xiàn)了模擬自然生境的新技術(shù)，如原位培養(yǎng)和iChip等高通量培養(yǎng)裝置。iChip利用半透膜允許環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)和信號分子自由擴(kuò)散，同時將微生物限制在微孔中，顯著提高了不可培養(yǎng)微生物的分離率，為從微生物“暗物質(zhì)”中發(fā)現(xiàn)新活性分子提供了途徑。
基因組挖掘策略
基因組挖掘是基于微生物基因組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物的整合研究策略，其方法多樣且不斷發(fā)展。基因編輯技術(shù)如CRISPR和多重堿基編輯（Multiplex Base-Editing, MBE）的結(jié)合，顯著增強了次級代謝物的發(fā)現(xiàn)和生產(chǎn)能力。
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基因敲除（Gene Knockout）：用于精確消除特定基因功能。例如，在極地真菌Eutytella sp. D-1中敲除三萜環(huán)化酶關(guān)鍵基因，誘導(dǎo)代謝流重編程，激活了沉默的次級代謝基因簇，分離到8個新結(jié)構(gòu)化合物，其中一種蒽型倍半萜在細(xì)胞和斑馬魚模型中通過調(diào)節(jié)MAPK和NLRP3/caspase-1信號通路顯示出顯著抗炎活性。
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同源重組（Homologous Recombination）：實現(xiàn)無縫基因替換或插入。在真菌Calcarisporium arbuscula中，通過同源重組敲除aurocertins基因簇的DaurA基因，并鑒定強效啟動子，成功激活了內(nèi)源性聚酮合酶（PKS）基因簇，并實現(xiàn)了外源真菌PKS基因簇的高效異源表達(dá)，拓寬了aurovertin類聚酮的結(jié)構(gòu)多樣性。
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轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)（Transcription Factor Overexpression）：放大限速轉(zhuǎn)錄激活因子以克服代謝瓶頸。例如，在Talaromyces sp.中過表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子LutB，激活了一個隱性代謝途徑，產(chǎn)生五個結(jié)構(gòu)新穎的sclerotiorin型氮雜菲酮。在Calcarisporium arbuscula中過表達(dá)一個途徑特異性轉(zhuǎn)錄因子，激活了沉默的mca17基因簇，產(chǎn)生了一個新型四酸類化合物MCA17-1，該化合物在TGF-β誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化模型中顯示出顯著抑制活性。
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結(jié)構(gòu)特征導(dǎo)向的基因簇定位策略（Structure-Feature-based Gene Cluster Localization）：以 strained cyclophane 為關(guān)鍵生物合成片段，開發(fā)新的天然產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)方法。利用HqlABC這一“最小環(huán)芳烷形成盒”作為靶點，從保守基因簇中發(fā)現(xiàn)了具有復(fù)雜八環(huán)結(jié)構(gòu)的octacycline A。
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核心生物合成酶的保守性挖掘（Conservativity Mining of Core Biosynthetic Enzymes）：針對四種重要農(nóng)業(yè)病原真菌，基于高度還原型聚酮合酶（HRPKSs）錨定的BGCs，發(fā)現(xiàn)了一個在病原菌和木霉（如生防菌T. afroharzianum t-22）中高度保守的BGC，并從中鑒定出具有萜類樣反式稠合5,7-雙環(huán)核心骨架的新化合物treconorin。
基因組挖掘與代謝分析整合
為彌合基因組預(yù)測與具體化學(xué)實體之間的差距，基因組挖掘需要與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）、高分辨率核磁共振（NMR）等先進(jìn)結(jié)構(gòu)分析平臺協(xié)同整合。這種多學(xué)科融合不僅加速了已知化合物的去重復(fù)，還能快速解析新骨架結(jié)構(gòu)，顯著縮短發(fā)現(xiàn)時間線，并通過最小化冗余代謝物的分離優(yōu)化了藥物開發(fā)中天然產(chǎn)物研發(fā)管線的成本效益。
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同源性基因組挖掘與HPLC-MS驗證技術(shù)結(jié)合：基于關(guān)鍵生物合成酶C-糖基轉(zhuǎn)移酶（AuCGT）的酶導(dǎo)向基因組挖掘策略，結(jié)合HPLC-MS驗證，從多種真菌菌株中鑒定出多個BGCs，表征了20個新型芳香聚酮C/O-糖苷，并通異源表達(dá)進(jìn)行了組合生物合成。這些糖苷顯示出顯著的抗病毒、抗菌和抗糖尿病活性。對海洋真菌Aspergillus sydowii的基因組挖掘和GNPS分子網(wǎng)絡(luò)分析，導(dǎo)向了11個具有神經(jīng)保護(hù)活性的呫噸酮生物堿的發(fā)現(xiàn)。
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NMR代謝組學(xué)與基因組挖掘耦合：對海洋來源鏈霉菌Streptomyces sp. S063的提取物進(jìn)行NMR代謝組學(xué)分析，觀察到罕見的特征信號，提示存在結(jié)構(gòu)新穎的N-甲基化肽類代謝物。基因組挖掘進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了一個獨特的非核糖體肽合成酶（NRPS）基因簇，基于此通過HRESIMS/MS分析注釋了lenziamides D1和B1，兩者對多種人類癌細(xì)胞系顯示出中等生長抑制活性。
機器學(xué)習(xí)驅(qū)動策略
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AI輔助酶定制平臺（AI-facilitated Enzyme Tailoring Platform）：開發(fā)了基因組挖掘工具包NPtagM，用于定制天然產(chǎn)物的多樣化。該工具優(yōu)化了算法架構(gòu)，將P450酶的預(yù)測效率提升至現(xiàn)有工具antiSMASH的三倍。利用NPtagM系統(tǒng)分析真菌基因組，從一個去重復(fù)后的萜類P450酶家族中識別出可能參與艾里莫芬烷型（eremophilane-type）倍萜生物合成的P450酶，并通過異源表達(dá)成功獲得兩個新化合物。
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智能CRISPR引導(dǎo)的基因組工程（Intelligent CRISPR-guided Genome Engineering）：結(jié)合CRISPR-Cas9系統(tǒng)與堿基編輯工具，開發(fā)了多重堿基編輯（MBE）平臺，可在絲狀真菌中實現(xiàn)高通量基因編輯，單次轉(zhuǎn)化可同時編輯多達(dá)八個基因。利用該技術(shù)組合調(diào)控Aspergillus nidulans中的三個表觀遺傳調(diào)控因子（CclA, ClrD, HdaA），成功激活了八個沉默的BGCs，分離到四個結(jié)構(gòu)新穎的化合物。此外，開發(fā)的CRISPR-Cas9基因編輯工具ACTIMOT，能夠原位切除轉(zhuǎn)移大型染色體DNA片段（如BGCs）至自主復(fù)制質(zhì)粒，成功激活了鏈霉菌中的四個隱秘基因簇，發(fā)現(xiàn)了39個結(jié)構(gòu)多樣的新型天然產(chǎn)物。
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結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的智能篩選（Structure-Oriented Intelligent Screening）：基于深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)開發(fā)了抗菌活性預(yù)測模型，并創(chuàng)新性地應(yīng)用于雙軌篩選策略：一方面虛擬篩選ZINC15數(shù)據(jù)庫中的超過1.07億個分子，實驗驗證了8個新型抗菌化合物；另一方面結(jié)合靶向藥物重定位技術(shù)，從“藥物重定位中心”庫中高效識別出結(jié)構(gòu)創(chuàng)新的抗生素halicin，其對臨床關(guān)鍵病原體具有廣譜抗菌活性。此外，建立了結(jié)構(gòu)導(dǎo)向餾分篩選平臺（SFSP），整合機器學(xué)習(xí)算法與多維光譜數(shù)據(jù)，實現(xiàn)了從提取物庫MS1質(zhì)譜數(shù)據(jù)和1H-PSYCHE-NMR譜圖中直接預(yù)測化合物節(jié)點的化學(xué)位移，從而不依賴數(shù)據(jù)庫進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征分析。利用該平臺從深海熱液口真菌Aspergillus sp. GE2-6中成功鑒定出兩類新型天然產(chǎn)物：通過1H NMR烯烴信號指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)的Flavipidin類化合物，以及通過1H NMR低場羥基信號指導(dǎo)發(fā)現(xiàn)的Phenalenones類化合物，部分化合物顯示出顯著的抗流感病毒或抑制HIV假病毒感染活性。
總結(jié)與展望
當(dāng)前策略各有特點：OSMAC策略簡單但產(chǎn)物不可控、產(chǎn)量低；結(jié)構(gòu)定位策略目標(biāo)性強但依賴已知數(shù)據(jù)庫；核心生物合成酶保守性挖掘適合高通量篩選但可能漏掉非典型酶；組學(xué)整合策略中，HPLC-MS靈敏度高但依賴譜庫，NMR結(jié)構(gòu)解析精確但靈敏度有限；機器學(xué)習(xí)驅(qū)動策略中，NPtagM平臺可加速結(jié)構(gòu)衍生化但預(yù)測非經(jīng)典修飾性能不佳，CRISPR堿基編輯可精確激活沉默基因簇，深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可進(jìn)行虛擬篩選但需要大樣本量訓(xùn)練。
當(dāng)前研究的核心矛盾在于微生物基因組數(shù)據(jù)快速增長（已測序超過20萬個基因組），但系統(tǒng)性研究比例極低。未來突破應(yīng)聚焦三個維度：技術(shù)創(chuàng)新層面，需開發(fā)新的培養(yǎng)技術(shù)和單細(xì)胞分析方法以獲取不可培養(yǎng)微生物資源；策略優(yōu)化層面，需要更深度的多組學(xué)整合，特別是建立“基因組-轉(zhuǎn)錄組-代謝組”關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)；方法創(chuàng)新關(guān)鍵在于跨學(xué)科融合，包括：(1) 生物信息學(xué)驅(qū)動的智能預(yù)測，(2) 合成生物學(xué)指導(dǎo)的理性設(shè)計，以及 (3) 微流控技術(shù)實現(xiàn)的高通量篩選。隨著CRISPR等技術(shù)的突破，微生物次級代謝研究已進(jìn)入黃金發(fā)展時期。構(gòu)建“數(shù)據(jù)驅(qū)動實驗、實驗驗證反饋、工程優(yōu)化”的研究框架，有望在制藥和農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面帶來變革性突破。
