柑橘作為全球廣泛栽培的重要水果作物，在育種改良中面臨諸多挑戰(zhàn)。傳統(tǒng)育種方法由于柑橘漫長的幼年期及其他限制，在抗病性提升方面進(jìn)展緩慢。CRISPR介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)為植物遺傳改良提供了新途徑，但在甜橙中由于轉(zhuǎn)化效率和再生效率低下，獲得雙等位或純合突變體仍非易事。有趣的是，植物激發(fā)子肽（Pep）——再生因子1（REF1）已知能促進(jìn)番茄的再生和轉(zhuǎn)化效率。那么，REF1能否同樣提升柑橘的轉(zhuǎn)化和再生效率呢？這正是本研究旨在探索的核心問題。

為了回答這個問題，研究人員根據(jù)甜橙（Citrus sinensis）、葡萄柚（C. paradisi）和番茄中的REF1蛋白序列，合成了相應(yīng)的肽段CsREF、CgREF和SgREF。他們測試了1 nM、10 nM和100 nM濃度下這三種REF肽對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明，所有三種REF肽均能有效增強(qiáng)柑橘的轉(zhuǎn)化和再生效率。尤為突出的是，100 nM的CsREF處理獲得了最高的轉(zhuǎn)化效率，相較對照組提升了4.8倍。這項研究證實，應(yīng)用REF肽能夠顯著提高柑橘的轉(zhuǎn)化和再生效率，從而為柑橘的遺傳學(xué)研究和遺傳改良工作掃除了重要障礙。該研究發(fā)表于《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal》期刊。

本研究的關(guān)鍵技術(shù)方法主要包括：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，用于將目的基因?qū)�入柑橘外植體；體細(xì)胞胚胎發(fā)生和器官發(fā)生再生體系，用于從轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞再生完整植株；以及合成肽處理，通過添加不同濃度的REF肽來優(yōu)化轉(zhuǎn)化效率。研究使用了柑橘上胚軸作為外植體材料。

研究人員通過設(shè)置不同濃度（1 nM, 10 nM, 100 nM）的CsREF、CgREF和SgREF處理組，并以不加肽的處理作為對照，系統(tǒng)評估了REF肽對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘上胚軸轉(zhuǎn)化的影響。結(jié)果表明，所有三種測試的REF肽均能提高轉(zhuǎn)化效率，其中100 nM的CsREF效果最為顯著，使轉(zhuǎn)化效率相比對照組提高了4.8倍。這證明REF肽，特別是CsREF，在優(yōu)化柑橘轉(zhuǎn)化體系中具有巨大應(yīng)用潛力。

除了轉(zhuǎn)化效率，植株再生是遺傳轉(zhuǎn)化成功的另一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究觀察到，經(jīng)REF肽處理的實驗組，其外植體不僅產(chǎn)生更多的抗性愈傷組織，而且這些愈傷組織分化出綠色芽點的能力和后續(xù)成苗率也明顯高于對照組。這說明REF肽不僅作用于T-DNA的整合過程，還可能通過調(diào)控內(nèi)源激素通路或細(xì)胞分裂活性，共同促進(jìn)了整個再生過程。

本研究的結(jié)論明確：植物激發(fā)子肽REF1（特別是其柑橘同源物CsREF）的應(yīng)用，可以顯著提高柑橘農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化效率和植株再生效率。這一發(fā)現(xiàn)具有重要的理論與實踐意義。在理論層面，它揭示了REF肽在木本果樹作物中具有保守的促進(jìn)再生和轉(zhuǎn)化的功能，擴(kuò)展了我們對植物肽激素功能的認(rèn)識。在實踐層面，建立高效、穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系是開展柑橘基因功能研究和分子育種的前提。本研究成功地將轉(zhuǎn)化效率提升了近5倍，這大大加速了利用CRISPR等基因組編輯技術(shù)進(jìn)行柑橘性狀改良的進(jìn)程，例如培育抗病新品種。此外，該技術(shù)策略有望推廣到其他轉(zhuǎn)化困難的植物物種，為園藝作物的生物技術(shù)育種提供了新的技術(shù)思路和解決方案。

綜上所述，這項研究通過引入REF肽優(yōu)化轉(zhuǎn)化流程，為解決柑橘遺傳轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵瓶頸提供了有效策略，對推動柑橘乃至其他難轉(zhuǎn)化作物的生物技術(shù)研究具有重要意義。