在作物改良和功能基因組學研究領域，高效、精準的遺傳轉化和基因編輯技術一直是科學家們追求的目標。然而，許多具有重要經濟價值的植物物種，特別是多年生無性繁殖作物如林木和特色水果，仍然難以進行遺傳轉化。傳統的組織培養再生方法往往耗時漫長、基因型依賴性強，且成功率低。此外，利用基因編輯技術改良作物時，編輯工具（如CRISPR/Cas系統）通常以穩定轉基因的形式整合到植物基因組中。對于無性繁殖作物，無法通過有性雜交的后代分離來去除這些外源基因，這可能導致監管問題并限制其商業化應用。因此，開發能夠產生無轉基因殘留的編輯植株，且適用于廣泛物種的高效再生與轉化系統，成為植物生物技術領域亟待突破的瓶頸。

為了應對這些挑戰，研究人員在《In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal》2025年會議論文集中報告了一系列創新性研究。這些研究旨在開發新的技術平臺，以簡化轉化流程、提高編輯效率，并最終獲得無轉基因的編輯植株。

本研究主要運用了幾項關鍵技術：利用發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）介導的毛狀根誘導與再生技術；基于Cre-lox系統的可誘導轉基因切除技術；利用形態發生轉錄因子（如WUSCHEL、BBM、GRF-GIF等）增強植物再生能力；新型CRISPR系統（如I-F型MmeCascade）的應用；以及農桿菌VirD2突變體策略以實現高瞬時轉化效率但低穩定整合的基因編輯。部分研究還涉及人工智能輔助分析和多組學（轉錄組、蛋白組、代謝組）整合研究。

Greg S. Goralogia及其同事開發了一套名為RESET的創新系統。該系統利用發根農桿菌誘導產生毛狀根，并通過合成基因電路整合了毛狀根rol基因、誘導型莖誘導基因（如WUSCHEL和ipt）以及位于T-DNA邊界附近的Cre-lox切除系統。研究顯示，在楊樹中，42%的外植體成功誘導出毛狀根。經過兩周的熱激脈沖處理（每天39°C 4小時），三分之二的外植體至少再生出一個莖，其中三分之一的外植體再生出超過10個莖。值得注意的是，三分之一的再生莖實現了轉基因切除，并且幾乎所有切除后的莖都在兩個CRISPR/Cas9靶向基因的至少一個等位基因上顯示出編輯痕跡。該系統為多種無性繁殖作物生成無CRISPR-Cas殘留的編輯植株提供了高效方法。

Tao Jiang的研究團隊探索了通過調控DA1-EOD1模塊的相互作用來改變生菜器官大小的潛力。他們通過CRISPR基因編輯技術構建了da1/eod1雙突變體，并通過過表達構建了DA1ox株系。結果表明，da1/eod1雙突變體表現出生長速率增加，葉片大小是對照植株的三倍，并顯著延遲了葉片衰老，葉綠素含量更高。相反，DA1ox株系生長速率降低，葉片大小約為對照的三分之二，葉片衰老加速。這些大小變化歸因于細胞擴張和增殖的改變。該研究為開發具有更高產量和更好采后品質的生菜品種提供了新思路。

C. D. Nguyen等人利用CRISPR/Cas9基因編輯、RNA干擾和過表達等技術，操縱了生菜中ABA-Hypersensitive Germination 1 (AHG1)、AHG3、DELAY OF GERMINATION 1 (DOG1)、miR156和miR172等關鍵調控因子。研究發現，lsahg1和lsahg3突變體表現出萌發顯著延遲、ABA敏感性增加以及發育轉換受損。DOG1沉默導致早花，而miR156過表達和miR172沉默強烈延遲開花。對lsahg3突變體的RNA測序分析揭示了參與ABA信號通路和種子休眠的差異表達基因，表明ABA感知和信號轉導過程被打亂。這些發現為培育在高溫度脅迫下具有改善萌發和延遲抽薹能力的氣候適應性生菜品種奠定了基礎。

Arjun Ojha Kshetry團隊開發了一種無縫且用戶友好的系統，通過在非分生組織的節間應用包含傷口誘導再生途徑、植物發育調節因子和基因編輯試劑的合成級聯反應，來誘導轉基因和基因編輯的從頭分生組織。該工具包已成功應用于本氏煙、番茄和大豆，為克服植物生物技術中的瓶頸提供了一種變革性方法，有望在不依賴傳統組織培養中間步驟的情況下加速轉基因和基因編輯植物的生成。

Joshua Clem等人發現并測試了一種來自Methylomonas methanica的I-F型CRISPR系統（MmeCascade）。當在轉基因水稻中表達時，含有獨特Cas3-Cas2融合蛋白的MmeCascade能在兩個含有GC豐富PAM（原型間隔序列鄰近基序）的基因組靶位點產生數千堿基對的大規模缺失。這些缺失是雙向的，并且編輯效率很高。該研究還配套使用了適配于牛津納米孔DNA長片段測序的基因組編輯分析工具。這一新型系統使得在植物中高效實現大規模基因組擾動成為可能。

Anshu Alok團隊開發了一種利用發育調節因子（DRs）促進從萌發胚直接再生莖的簡化轉化方法。WUSCHEL2 (WUS2) 和異戊烯基轉移酶 (IPT) 的共表達在Williams 82和Bert品種中實現了15.2%至22.3%的轉化效率，且無需外源激素或選擇劑。轉錄組分析表明，WUS2/IPT協同調節應激反應并激活細胞再生通路。這種無激素、無選擇的轉化方法能在9-11周內快速獲得轉基因植株，并成功遞送CRISPR-Cas9組件，產生了可遺傳的突變，效率達20%。

S. B. Gelvin團隊開發了virD2突變農桿菌菌株，這些菌株能高效地瞬時轉化并編輯擬南芥和本氏煙基因組（效率50-100%），但穩定轉化水平極低。這些突變VirD2蛋白不與DNA聚合酶θ（一種對T-DNA整合重要的蛋白）相互作用。該技術為無轉基因基因組編輯及理解T-DNA整合的分子過程提供了有力工具。

A. J. Villacastin研究將小麥的GRF4和GIF1串聯基因通過農桿菌介導轉化導入高粱。穩定表達小麥GRF4和GIF1串聯基因對高粱轉化產生積極影響，再生能力最高提升48%。這為克服高粱遺傳轉化的主要障礙，開發改良高粱品種用于生物能源應用提供了新策略。

Valentino Giarola團隊開發了名為BioMaas的工作流程，旨在快速生產無轉基因CRISPR編輯作物。該流程以原生質體作為標準平臺，通過PEG（聚乙二醇）介導遞送RNPs（核糖核蛋白）。利用基于MAD7的RNPs，在轉染的原生質體中編輯效率達到70-95%。為了克服植物再生難題，該技術整合了多種策略，包括專有水凝膠配方用于原生質體包埋，以及高通量篩選以優化微愈傷組織形成和莖誘導條件。該流程已成功應用于超過17種不同作物。

綜上所述，本系列研究在植物遺傳轉化和基因編輯技術領域取得了顯著進展。通過開發新型再生系統（如RESET毛狀根系統、形態發生轉錄因子輔助再生）、創新基因編輯工具（如I-F型CRISPR、RNP直接遞送）以及探索減少轉基因殘留的策略（如Cre-lox切除、VirD2突變體），這些研究為解決植物生物技術中長期存在的瓶頸問題提供了多樣化且高效的解決方案。特別是在擴大宿主范圍、提高編輯效率、簡化操作流程和確保生物安全性方面展現了巨大潛力。這些技術的成功應用和優化，將極大地加速作物精準育種進程，對保障糧食安全、開發新型生物能源作物以及推動農業可持續發展具有深遠意義。然而，將這些技術廣泛應用于更多難轉化物種、進一步提高再生和編輯效率、確保其穩定性和安全性，仍是未來需要持續探索的方向。