引言

在過去的幾十年里，高毒力肺炎克雷伯菌（hvKp）在亞太地區的流行情況令人擔憂，尤其與社區獲得性化膿性肝膿腫相關。這種病原體的特點是多部位感染、高侵襲性和致病性，常導致嚴重后遺癥。因此，有效區分hvKp與經典肺炎克雷伯菌（cKp）對于指導臨床感染管理至關重要。關鍵毒力基因已被確定為hvKp毒力最可靠的分子標志物，能夠準確區分hvKp和cKp。常見的用于區分hvKp的毒力基因包括rmpA、iroB、iucA和peg-344。rmpA基因是hvKp的核心生物標志物，調節莢膜多糖合成，從而增強細菌粘附、抗吞噬作用和生物膜形成。iroB基因是沙門菌素鐵載體生物合成簇的一部分，介導鐵獲取。iucA基因是氣桿菌素生物合成基因簇的關鍵組成部分，編碼一種鐵載體，促進細菌對鐵的螯合。iroB和iucA的存在增強了鐵獲取——這是細菌生存和毒力的關鍵過程。peg-344基因編碼一種位于內膜的轉運蛋白，可增強肺炎克雷伯菌的生存和競爭適應性。此外，該基因對于細菌在肺部攻擊模型中實現完全毒力是必不可少的。流行病學分析已證實，聯合檢測rmpA、iroB、iucA和peg-344對hvKp豐富人群中的hvKp鑒定診斷準確度大于0.95。傳統的hvKp檢測技術，如實時熒光定量PCR（qPCR）和基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜（MALDI-TOF MS），對于實際評估致病潛力過于繁瑣。因此，迫切需要開發快速、用戶友好、高靈敏/高特異性的針對多種hvKp毒力基因的即時診斷（Point-of-Care）技術。

近年來，基于CRISPR Cas，特別是CRISPR Cas12a的檢測系統在診斷各種病毒和細菌方面獲得了廣泛認可。該系統減少了對實驗室基礎設施的依賴，并提供快速、易于解讀的結果，其靈敏度可與實時PCR相媲美。科學家們已利用CRISPR Cas檢測系統診斷耐藥基因和毒力基因。例如，Xu等人創建了結合Cas12a和環介導等溫擴增（LAMP）的側流層析試紙條，可在1小時內識別碳青霉烯酶耐藥基因KPC和NDM。Chao等人開發了一種基于Cas12a并結合重組酶聚合酶擴增（RPA）的方法，檢測hvKp特異性標志基因peg-344和rmpA。這些研究突出了CRISPR-Cas系統在鑒定肺炎克雷伯菌耐藥和毒力基因方面的潛在作用。

目前，這些測試主要依賴專業人員或昂貴設備，如熒光定量PCR儀和紫外分光光度計。然而，由于這些設備通常體積大、成本高，并且需要在資源有限的環境下監督使用，因此在此類環境中效果不佳。為了應對這一挑戰，新興的生物傳感技術提供了傳統方法的實用替代方案，并越來越受歡迎。通過將比色檢測與智能手機等便攜設備集成，這些系統為即時生化分析提供了簡單、交互式的信息。

材料與方法

本研究中使用的高毒力肺炎克雷伯菌菌株SZ859、X22-3和FY-841來自實驗室保存菌株。所有菌株均從臨床標本中分離，并已確認分別攜帶毒力基因rmpA、iroB、iucA和peg-344。此外，從廣東醫科大學附屬第一醫院的患者中收集了幾株肺炎克雷伯菌臨床分離株（KP84844, KP84703, hvKP17104, hvKP69670）。所有菌株均在生物安全2級（BSL-2）實驗室中處理。

菌株在37°C培養6-8小時，然后稀釋至0.5麥氏濁度（MCF）單位。為了選擇最合適的臨床hvKp樣本基因組DNA提取方法，使用了多種方法提取菌株基因組DNA：天根細菌DNA試劑盒、堿裂解法、熱裂解法、PBS凍融法、純水裂解法和異硫氰酸胍（GITC）裂解液提取法。通過DS-11系列分光光度計/熒光計測量細菌基因組DNA的濃度和純度。

目標DNA片段rmpA、iroB、iucA和peg-344保存在實驗室。攜帶LbCas12a基因的質粒pET28a來自吉林大學實驗室保存菌株。重組酶輔助擴增（RAA）試劑盒購自杭州眾測生物科技有限公司。引物、單鏈DNA（ssDNA）報告基因和CRISPR RNA（crRNA）由生工生物工程（上海）股份有限公司和華大基因合成。

簡要來說，用pET28a-Cas12a表達質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3），并在補充有卡那霉素（25 μg/mL）的LB培養基中培養。然后加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度95 μg/mL。細菌在16°C培養16-18小時。采用親和層析純化Cas12a蛋白。純化的Cas12a蛋白收集并使用30 kDa超濾膜管濃縮。通過SDS-PAGE分析凝膠過濾組分，并使用BCA蛋白測定試劑盒測量蛋白濃度。使用緩沖液A（20 mM HEPES, pH 7.5, 0.5 mM TCEP, 150 mM NaCl, 和50% (v/v) 甘油）儲存純化的Cas12a蛋白，并于-80°C保存。

為防止RNA降解，crRNA通過體外轉錄（IVT）獲得。合成單鏈DNA寡核苷酸（包含靶序列及其互補序列）并退火形成雙鏈DNA。然后使用HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit轉錄crRNA。產生的crRNA使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit純化，使用DS-11系列分光光度計/熒光計定量，稀釋至統一濃度1 μM，并于-80°C保存。

為優化反應體系，為每個毒力基因設計了三種不同的crRNA，每種靶向DNA的不同區域。根據相應熒光曲線的斜率選擇最佳crRNA。還優化了crRNA（17.5, 35, 和70 nM）和Cas12a酶（15, 30, 和60 nM）的濃度。此外，發現加入RNase抑制劑會影響檢測性能，并相應標準化了其濃度。最后，優化了熒光報告探針的濃度以最小化總反應時間。

對于檢測實驗，測試樣品的基因組DNA首先使用RAA系統進行擴增。根據制造商說明在50 μL混合物中組裝RAA反應，包含每種引物2 μL（10 μM），25 μL緩沖液A，2.5 μL緩沖液B，和5 μL樣品基因組DNA，體積用無核酸酶水補足至50 μL。擴增過程在37°C進行20分鐘。

最終的Cas12a-SACQP檢測反應在50 μL體積中進行，包含25 μL RAA擴增產物，30 nM Cas12a，35 nM crRNA，300 nM ssDNA，2.5 μL 10×反應緩沖液，和1 U RNase Inhibitor, Murine。體積用無核酸酶水調整至50 μL。進行不含任何模板的陰性對照反應，反應在37°C于熒光計中孵育30分鐘，每分鐘監測一次熒光（激發：492 nm；發射：517 nm）。

為確定檢測限，將基因組DNA從1 fM連續稀釋至1 nM并進行分析。通過用非靶標DNA挑戰評估CRISPR Cas12a輔助檢測的特異性，同時使用包含多個毒力基因模板的混合物評估其抗干擾能力。所有反應均使用上述RAA-CRISPR–Cas12a方案進行。

為便于結果可視化，構建了一個便攜式檢測設備。外殼由黑色亞克力板制成，以最大限度地減少光干擾。頂部中心的圓形開口可容納光學濾光片，使后置的智能手機攝像頭能夠捕獲圖像。內部，樣品室由藍色發光二極管（LED, 470 nm）從側面照明。整個系統由移動電源供電，通過消除對固定電源適配器的需求來增強便攜性。

為確保樣品照明均勻，精確控制了每側的光束數量和燈條之間的間距。此外，為了標準化不同智能手機型號的輸出，使用熒光物質稀釋系列（范圍從2×10^–5到2 μg/mL）對設備進行了校準。

開發了一個名為比色定量可視化檢測平臺（CQVIP）的創新快速病原體檢測平臺，以簡化操作和數據分析。CQVIP是一個使用JavaScript和Python構建的微信小程序。其功能包括智能手機型號選擇、圖像采集、感興趣區域（ROI）顏色提取、數據分析和歷史數據檢索。用戶選擇移動設備，上傳樣品照片，并定義ROI以獲得分析結果——在本研究中，是RGB顏色模型中的綠色通道強度。該平臺還生成擬合線和濃度散點圖以可視化數據趨勢。

為了評估CRISPR Cas12a檢測的臨床檢測性能，首先通過使用熱裂解法提取的基因組DNA確定其靈敏度。隨后，使用臨床分離株評估靈敏度，hvKp基因組DNA濃度范圍為1.5×10¹到1.5×10⁶CFU/mL。結果使用便攜設備獲取，數據處理使用CQVIP系統進行。此外，將已知量的通過熱裂解提取的hvKp基因組DNA加標到五個唾液樣本中。這些加標樣本在雙盲條件下制備，并在使用Cas12a-SACQP分析后計算準確率。

最終，我們使用幾種臨床分離株驗證了Cas12a-SACQP系統。這些菌株，命名為KP84844、KP84703、hvKP17104和hvKP69670，是從不同患者的不同樣本類型中分離得到的，并來自廣東醫科大學附屬醫院臨床實驗室。所有臨床菌株均通過16S rDNA測序和MALDI-TOF MS確認為肺炎克雷伯菌。

為了比較不同臨床樣本類型中不同肺炎克雷伯菌菌株的各種檢測方法，我們并行使用了三種方法：基因測序、qPCR和Cas12a-SACQP。使用熱裂解法提取基因組DNA。對于基因測序，引物序列在補充材料表S3中給出。PCR反應混合物包含12.5 μL 2× Taq PCR MasterMixII，每種引物1 μL（10 μM），1 μL DNA模板，和無核酸酶水至終體積25 μL。反應在95°C進行60秒，隨后進行35個循環：95°C 10秒，56°C 15秒，72°C 30秒。PCR產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分析，隨后送至華大基因進行基因測序。對于qPCR檢測，四個靶毒力基因的序列詳見表S3。反應體系詳情如下：10 μL Premix Taq，1 μL引物（3 μM），2 μL DNA模板，和無核酸酶水至20 μL。反應條件包括95°C變性3分鐘，隨后進行40個循環：95°C變性5秒，60°C退火40秒，72°C延伸60秒，最后在72°C延伸8分鐘。

使用GraphPad Prism 9和Origin 2021進行數據分析和繪圖。所有數據顯示為平均值±標準差（SD）。檢測限（LOD）基于公式3σ/斜率計算，其中σ代表三個對照樣品測量的標準差。當僅比較兩組時，使用t檢驗確定是否存在統計學顯著性。顯著性水平表示為*p < 0.05, p < 0.01,p < 0.001, 和***p < 0.0001。

結果

構建了用于檢測hvKp毒力基因的基于CRISPR Cas12的智能手機輔助比色定量平臺（Cas12a-SACQP）。工作原理如下：首先，提取細菌基因組DNA，并通過重組酶輔助擴增（RAA）進行特異性擴增，獲得靶標雙鏈DNA（dsDNA，橙色），而無模板（黑色）則無法被擴增和識別。當Cas12a-crRNA復合物識別靶標dsDNA后，Cas12a的反式切割活性被激活，無差別地降解反應體系內的ssDNA報告基因，產生熒光信號。該原理被整合到Cas12a-SACQP技術中用于細菌DNA檢測。自定義開發的智能手機應用程序CQVIP自動分析結果。使用便攜設備進行視覺檢測的過程如圖所示，補充圖S1顯示了整個內部結構的便攜設備示意圖。建立了將樣品濃度與RGB值相關聯的回歸曲線。首先，調用CQVIP識別熒光圖像，并根據RGB值繪制擬合曲線。該擬合曲線有效地將RGB值轉換為樣品濃度，從而能夠對CRISPR Cas12a輔助檢測產生的熒光信號進行定量分析。最后，將綠色通道RGB強度擬合到回歸曲線以獲得樣品濃度，實現定量檢測。總之，利用顏色變化來檢測細菌DNA的濃度。

為建立細菌DNA檢測系統，系統地優化了每個組件以最大化檢測效率。關鍵因素是最佳crRNA的選擇和Cas12a酶的酶活性，這顯著影響檢測系統的性能。首先，表達并純化了LbCas12a酶（Lachnospiraceae bacterium ND2006），并證明其酶活性不劣于商業酶（圖S2）。隨后，為每個靶毒力基因設計了三種特異性crRNA。每種crRNA都包含了限制性內切酶LbCas12a特異性識別序列（TTTV），以靶向不同毒力基因的編碼鏈。所選crRNA及其檢測靶序列列于表S1和S2；篩選、檢查并在實時熒光定量儀器上測試了十二種潛在的crRNA。根據結果，為rmpA、iroB、iucA和peg-344選擇的最佳crRNA分別是rmpA-3-544（信噪比S/N = 2.91）、iroB-3-588（S/N = 7.01）、iucA-1-1155（S/N = 11.55）和peg-344-231（S/N = 2.93）。這些被選用于所有后續檢測實驗。

優化Cas12a與crRNA的比例是必要的，因為它關鍵地決定了檢測性能。選擇35 nM crRNA和30 nM Cas12a的組合，因為其背景熒光最小，并且能夠顯著區分熒光強度，信噪比為10.52。此外，加入RNase抑制劑以增強crRNA穩定性，并且這種加入產生了顯著效果。我們監測了有和無RNase抑制劑情況下30分鐘內的熒光強度變化，進一步分析顯示，在30分鐘時間點，使用RNase抑制劑的熒光強度增加了27.73%。此外，通過改變探針濃度（最終濃度范圍100至500 nM）選擇了系統的最佳反應時間，最終決定后續實驗的切割時間為30分鐘（圖S3）。總之，25 μL檢測系統包含緩沖液、crRNA（35 nM）、LbCas12a（30 nM）、ssDNA-FQ（300 nM）和RNase抑制劑（1 U）。

為了驗證CRISPR/Cas12a輔助檢測的可行性，使用攜帶hvKp毒力基因的質粒進行了初步實驗。如圖所示（圖S4A-D），熒光強度隨著DNA濃度的降低而降低。線性定量范圍從1 fM到1 nM，毒力基因rmpA的方程為y = 318812log(x) – 445495（R²= 0.97），iroB基因為y = 255995log(x) + 48109（R²= 0.99），iucA基因為y = 354607log(x) – 77399（R²= 0.98），peg-344基因為y = 143827log(x) + 317028（R²= 0.98）。基于LOD = 3σ/斜率的計算，我們證明CRISPR/Cas12a輔助檢測對hvKp毒力基因的檢測水平達到0.1 fM。關于檢測的特異性，如圖所示（圖3E），結果表明只有當特異性靶標和crRNA同時存在時，Cas12a介導的反式切割才會啟動，這在所有四個基因中都是一致的。圖3F證明了陽性結果和包含所有四個靶基因等濃度混合樣品的信號讀出的 一致性，強調了其強大的抗干擾能力，并驗證了該檢測系統的臨床適用性。

為了檢測hvKp菌株中的毒力基因，我們探索了各種快速細菌DNA提取技術，詳見材料部分。這些方法包括熱裂解、堿裂解、PBS凍融、純水裂解以及使用GITC裂解液提取，并以TIANamp Bacterial DNA Kit作為陽性對照。最終，使用熱裂解法提取hvKp菌株的基因組DNA，因為它是最方便的DNA提取方法（表S4）。將傳代培養的hvKp菌株調整至光密度0.5 MCF（1 MCF = 1.5×10⁸CFU/mL），并在1.5×10¹至1.5×10⁶CFU/mL范圍內進行系列稀釋。熒光強度隨著病原體基因組DNA濃度的升高而增加，如圖S5A-D所示。

為了評估檢測加標樣品的臨床適用性，我們通過將攜帶毒力基因的hvKp菌株引入陰性唾液樣品中來制備加標樣品。隨后，將hvKp基因組DNA在1.5×10¹至1.5×10⁶CFU/mL范圍內以唾液為基質進行梯度稀釋。隨著濃度降低，觀察到歸一化熒光的劑量依賴性減少（圖4A），并且在病原體基因組DNA的對數濃度與熒光強度之間發現了穩健的線性關系（圖4B,C）。重要的是，所有基因的檢測限均在一小時內達到，病原體基因組rmpA為2.42 CFU/mL，iroB為2.33 CFU/mL，iucA為1.72 CFU/mL，peg-344為2.83 CFU/mL。總體檢測限為3 CFU/mL。此外，我們評估了Cas12a-SACQP平臺針對各種菌株的特異性。如圖4D-G所示，CRISPR-Cas系統選擇性檢測了攜帶毒力基因的肺炎克雷伯菌分離株，突出了其高特異性。結果表明基于CRISPR Cas12a的檢測對hvKp多種毒力基因具有高靈敏度、高特異性和可行性，揭示了其在檢測臨床樣品中的應用潛力。

為了證明CRISPR Cas12a檢測hvKp多種毒力基因在即時檢驗中的可行性，設計了一個結合手機應用信號讀出的便攜設備，其內部光學布局如圖5A所示，用戶友好界面如圖5B所示。使用智能手機攝像頭拍攝照片并上傳到名為CQVIP的手機應用。通過CQVIP執行的分析，我們獲得了測試樣品的RGB值及其相應的濃度信息。為了建立樣品濃度與RGB值之間的關系，我們為此使用了回歸曲線。該曲線有效地將RGB值轉換為樣品濃度值，從而能夠對CRISPR Cas12a輔助檢測產生的熒光信號進行定量分析。將RGB值輸入回歸曲線以獲得樣品濃度，實現定量檢測（圖5C）。

為了增強信噪比，優化了幾個參數：LED燈條的數量、它們的垂直位置以及圖像處理算法。這涉及應用閾值操作和形態學處理方法，利用均值濾波和雙邊濾波，來分離對應于最亮中心區域的ROI值。這種方法有效地消除了反光點，從而實現了更精確的檢測。我們最終選擇了“六控燈條-下方”組合在額定電壓5V下，因為其便攜性和高靈敏度優勢（圖S6；表S5）。此外，為了進一步最小化用戶分析管內熒光數據時的潛在偏差，我們使用三個智能手機品牌進行了試驗，并設定了一個檢測閾值，該閾值設置為非靶標對照分析得出的平均像素強度加上三個標準差。如圖S7所示，所有測試的智能手機品牌都獲得了良好的信噪比。

優化實驗條件后，我們使用“Cas12a-SACQP”評估加標樣品的靈敏度。如圖5D-G所示，熒光強度隨著病原體基因組DNA濃度的增加而增加。在1.5×10¹至1.5×10⁶CFU/mL范圍內觀察到病原體基因組DNA濃度與熒光強度之間的線性關系，并得到以下方程支持：病原體基因組rmpA為 y = 24.36log(x) + 65.27（R²= 0.98），iroB為 y = 23.85log(x) + 79.48（R²= 0.98），iucA為 y = 22.96log(x) + 70.82（R²= 0.97），peg-344