海洋，覆蓋地球表面超過70%的廣闊疆域，孕育著數量龐大、種類繁多的微生物資源。這些微生物為了適應高壓、高鹽、低溫等獨特的海洋環境，進化出了非凡的生物合成能力，能夠產生結構新穎、活性多樣的天然產物，為新藥研發提供了寶貴的化合物庫。然而，一個令人困擾的“沉默”現象極大地限制了我們對其潛力的挖掘：絕大多數海洋微生物的生物合成基因簇在常規實驗室培養條件下處于不表達或低表達狀態。更為棘手的是，許多海洋微生物，包括在海洋微生物群落中占比高達20%–60%的假交替單胞菌屬，由于其細胞壁結構、胞外多糖基質以及限制性內切酶修飾系統等適應性特征，導致其遺傳操作異常困難，特別是依賴電穿孔的基因編輯方法效率極低。這種遺傳上的“頑固性”成為了激活這些“寶藏”基因簇、發現新化合物的主要瓶頸。

為了破解這一難題，發表在《Synthetic and Systems Biotechnology》上的研究論文《RECC: A Red/ET–CRISPR/Cas9-based system enabling genome mining of marine Pseudoalteromonas for novel natural products》報道了一種創新的解決方案。研究人員開發了一種名為RECC的集成式基因編輯系統，該系統巧妙地將Red/ET同源重組的高效性與CRISPR/Cas9基因編輯的精準計數篩選能力相結合，旨在實現對海洋假交替單胞菌等難轉化微生物的高效、無縫（無標記）基因組編輯。

為開展本研究，研究人員主要應用了以下幾項關鍵技術：首先，通過生物信息學分析從假交替單胞菌中篩選并獲得特異性Red/ET重組酶基因；其次，構建了單質粒RECC系統，該系統將CRISPR/Cas9與Red/ET重組酶表達盒整合，并優化了同源臂與向導RNA的組裝策略，實現了一步吉布森組裝；再者，利用接合轉移而非電轉的方式將編輯質粒導入模式菌株P. flavipulchra DSM 14401（菌株來源于德國微生物菌種保藏中心DSMZ）中；最后，通過超高效液相色譜-高分辨質譜和核磁共振波譜等技術對激活產生的代謝產物進行分離和結構鑒定。

研究人員首先嘗試建立基于Red/ET重組酶的基因編輯方法。通過同源序列比對，他們從P. agarivorans Hao 2018菌株中鑒定并合成了一個Red/ET重組酶系統（Redαβ2018）。然而，對7種假交替單胞菌的電轉效率測試發現，除DSM 14401外，其他菌株均表現出極強的電轉抗性。即使對DSM 14401進行培養基、緩沖液和預培養時間等條件優化，其最高電轉效率也僅為約10²CFU/μg DNA，遠低于有效重組工程所需的閾值（通常需10⁴至10⁵CFU/μg DNA）。進一步研究發現，低效率可能與菌株分泌的胞外DNA酶對質粒DNA的快速降解有關。此外，研究人員評估了四種誘導型啟動子（P_tet, P_BAD, P_tac, P_Rha）在DSM 14401中的性能，最終選擇泄漏低、誘導效率高的四環素誘導型啟動子P_tet來控制重組酶的表達。盡管成功構建了重組酶表達質粒，但由于電轉效率過低，未能獲得預期的重組子，這表明單純依賴Red/ET系統在DSM 14401中難以實現有效編輯。

為了克服電轉效率的限制，研究人員將CRISPR/Cas9系統與Redαβ2018重組工程耦合，利用Cas9蛋白對未成功編輯的野生型細胞進行計數篩選，從而無需依賴高效率的電轉和抗生素標記篩選。他們首先驗證了CRISPR/Cas9系統在DSM 14401中的編輯效率，以一個高豐度的表層蛋白基因作為編輯靶點，成功實現了高效敲除。然而，也觀察到了CRISPR逃逸現象，即部分細胞未能被Cas9有效清除。通過對逃逸菌株的Cas9基因和靶位點序列進行分析，未發現常見的突變機制，推測DSM 14401可能存在未知的逃逸途徑。

隨后，研究人員構建了將Redαβ2018與CRISPR/Cas9整合的單質粒RECC系統。通過優化同源臂的長度，發現當同源臂長度達到100 bp時，編輯效率可超過20%。更重要的是，他們對質粒構建流程進行了重要改進，將同源臂直接連接在向導RNA的5‘端前，使得整個編輯質粒（包含Cas9、重組酶、同源臂和sgRNA）只需一步吉布森組裝即可完成，大大簡化了操作流程。實驗證明，這種設計不影響CRISPR/Cas9的功能，且Red/ET重組酶的存在對于同源重組的發生至關重要。

在成功建立高效、簡便的RECC基因編輯平臺后，研究人員利用其開展基因組挖掘。他們選擇DSM 14401中一個預測編碼脂肽類化合物的非核糖體肽合成酶-聚酮合酶雜合基因簇（命名為Pfl簇）作為靶點。通過RECC系統，將該基因簇的天然啟動子替換為來自P. flavipulchra S16的強組成型啟動子P₁₈，成功獲得了啟動子替換菌株（DSM 14401::P₁₈_Pfl），編輯成功率超過50%。作為對照，他們同時利用CRISPR/Cas9介導的非同源末端連接（NHEJ）構建了該基因簇的敲除菌株（DSM 14401ΔPfl），發現DSM 14401中的NHEJ主要表現為大片段的缺失，而非堿基的插入或缺失。

代謝產物分析顯示，與野生型和敲除菌株相比，啟動子替換菌株在多種培養基（2216E, PYG, CY）中均產生了一系列新的色譜峰，表明Pfl基因簇被成功激活。值得注意的是，這些新化合物在野生型菌株中也有微量存在，提示該基因簇在實驗室條件下呈低水平表達。

研究人員從6升發酵液中分離純化得到了兩個主要化合物flavipulchrin A (1) 和 B (2)。通過高分辨質譜、一維和二維核磁共振波譜（包括¹H NMR, ¹³C NMR, DEPT, COSY, HSQC, HMBC）等技術，解析了它們的化學結構。結果表明，這兩個化合物均為環狀脂肽，包含一個由甘氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、蘇氨酸、亮氨酸和精氨酸組成的七肽環，以及一個連接在N端的3-氨基脂肪酸鏈（1為3-氨基十二酸，2為3-氨基十一酸）。其中一個天冬酰胺殘基的β位被羥基化。通過Marfey's assay結合生物信息學分析，確定了大部分氨基酸的立體構型為L型，但亮氨酸為D型。令人意外的是，β-羥基天冬酰胺的構型被確定為(2R,3S)即D-構型，而其生物合成模塊中并未發現常見的差向異構化結構域，這暗示了一條新的氨基酸差向異構化途徑。

結合Pfl基因簇的組成和化合物結構，研究人員推測了flavipulchrins的生物合成途徑：起始于一個酰基輔酶A連接酶/合成酶結構域加載壬酸或癸酸作為起始單元，隨后經過一個聚酮合酶模塊延伸并引入氨基，形成3-氨基脂肪酸鏈。接著，多個非核糖體肽合成酶模塊依次裝配七個氨基酸。其中，一個獨立的TauD/TfdA家族雙加氧酶PflD可能負責天冬酰胺殘基β位的羥基化，并且可能也參與了其差向異構化過程。最后，硫酯酶結構域催化七肽環的C末端與3-氨基脂肪酸的氨基形成大環內酰胺，完成環化。

對flavipulchrin A和B進行了抗菌活性測試，結果顯示在高達1 mM濃度下，其對所選測試菌株（包括銅綠假單胞菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等）均未表現出明顯的抑制活性。

綜上所述，本研究成功開發了RECC這一創新的基因編輯平臺，有效克服了海洋假交替單胞菌遺傳操作難的瓶頸。該系統的核心優勢在于其單質粒設計、不依賴電轉和選擇標記、以及操作流程的極大簡化。應用RECC系統，研究人員成功激活了P. flavipulchra DSM 14401中的一個隱蔽生物合成基因簇，并發現了一類結構新穎的環脂肽flavipulchrins。特別值得注意的是，對這些化合物生物合成途徑的分析揭示了一個潛在的、前所未見的D-型β-羥基天冬酰胺生物合成機制，凸顯了海洋微生物次級代謝途徑的獨特性和新穎性。

盡管所發現的化合物在初步活性篩選中未顯示抗菌活性，但其新穎的結構本身就具有重要的化學價值，且不排除其可能具有其他尚未測試的生物功能。更重要的是，RECC系統的建立其意義遠不止于發現幾個新分子。它為解決非模式微生物，特別是來自特殊環境的微生物的遺傳操作難題提供了一個通用、高效的策略。這項研究不僅為深度挖掘假交替單胞菌屬乃至其他海洋微生物的巨大生物合成潛力打開了大門，也為利用合成生物學手段開發這些微生物的應用價值奠定了堅實的技術基礎。未來，通過對RECC系統效率的進一步優化（如闡明其CRISPR逃逸機制）以及將其推廣至更多難以進行遺傳操作的微生物類群，必將加速我們從這些“沉默的寶藏”中解鎖更多具有應用前景的天然產物和酶資源。