腹瀉是豬最常見的疾病之一，嚴重影響其生長發育。這種狀況會延長繁殖周期、降低飼料利用率、延遲屠宰時間，并導致高死亡率，給農民帶來巨大的經濟損失[1]。豬腹瀉的病因復雜，其中病毒感染是最嚴重的原因[2]。主要導致豬腹瀉的病毒包括豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）和豬輪狀病毒（PoRV）[3]、[4]、[5]。在PoRV株中，豬A組輪狀病毒（PoRVA）通常是與仔豬腹瀉疾病最相關的亞型[6]。PEDV、PDCoV和PoRVA都會引起類似的臨床癥狀，如嘔吐、腹瀉和脫水[7]、[8]、[9]。豬病毒性腹瀉對新生仔豬尤其有害，高死亡率會導致養豬企業無法挽回的經濟損失。更嚴重的是，PDCoV和PoRVA具有跨物種傳播的風險，對人類和動物健康構成重大威脅，被公認為全球公共衛生問題[10]、[11]。養豬業的迅速擴張增加了人與豬的接觸，從而增加了跨物種傳播的可能性，使得疫情預防和控制的難度加大。豬病毒性腹瀉引起的臨床癥狀和病理變化非常相似，使得鑒別診斷具有挑戰性[12]，在臨床實踐中很難區分這些病原體。此外，不同腹瀉病毒的混合感染也很常見，進一步復雜化了診斷和預防工作[13]。因此，開發一種新型的、快速的、準確的多重檢測方法對于這些導致豬腹瀉的病毒病原體的鑒別診斷至關重要。

目前，已經有多種檢測方法用于豬腹瀉病毒的診斷，主要分為血清學方法和分子生物學技術。血清學方法，如酶聯免疫吸附測定（ELISA）[14]、[15]和免疫層析[16]、[17]、[18]，成本低廉、操作簡單、檢測速度快，適合大規模樣本篩查。然而，這些方法的靈敏度和特異性通常較低。由于豬腹瀉病毒主要影響哺乳期仔豬[19]，而它們的免疫系統尚未成熟，因此從這些動物身上采集血液樣本具有挑戰性，從而限制了血清學方法在這些情況下的應用。相比之下，分子診斷方法更適合檢測豬腹瀉病毒。傳統的聚合酶鏈反應（PCR）[20]和實時定量PCR（RT-qPCR）[21]已被開發用于檢測PEDV、PDCoV和PoRVA，在靈敏度和特異性方面取得了顯著改進。然而，這些方法需要復雜的實驗室設施、昂貴的設備和復雜的操作程序，這阻礙了其在現場快速檢測中的應用，尤其是在資源有限或偏遠地區。因此，迫切需要

開發一種快速、靈敏、易于使用且可在現場應用的診斷平臺，能夠同時檢測多種豬腹瀉病毒。這樣的平臺對于資源匱乏地區的小規模養豬場尤為重要，可以實現早期診斷和及時干預疫情。近年來，基于智能手機的生物傳感器因其便攜性、實時性能和用戶友好的操作而成為強大的即時檢測工具[22]。智能手機體積小、便于攜帶、易于使用，可以實現實時監測[23]、樣本檢測、圖像分析和數據傳輸，其微型化的檢測系統相比傳統儀器成本更低、響應更快、部署更加靈活[24]、[25]。它們的廣泛可用性和多功能性推動了在研究和動物疾病診斷中的應用，使智能手機成為即時檢測技術的關鍵推動者[26]。

近年來，基于CRISPR的診斷系統作為一種快速高效的核酸檢測方法應運而生[27]。這些系統通過將CRISPR RNA（crRNA）與目標DNA配對，激活CRISPR蛋白的轉切割活性，從而在非目標單鏈RNA或DNA序列上誘導任意的內切酶活性[28]。為了進一步提高檢測的靈敏度和特異性，CRISPR系統通常與等溫擴增技術結合使用[29]。等溫擴增技術能夠在恒定溫度下快速高效地擴增核酸，無需昂貴的熱循環儀，使其成為PCR的理想替代方案[30]。在等溫擴增方法中，重組酶輔助擴增（RAA）因其簡單的引物設計、快速的反應速度、在相對較低溫度（37-42°C）下的高效擴增以及高特異性而得到廣泛應用[31]。值得注意的是，RAA的反應溫度與CRISPR系統的最佳工作溫度高度兼容，使得兩種技術可以無縫集成。這種耦合促進了快速等溫擴增和高特異性目標識別之間的協同效應，顯著提高了檢測的靈敏度，并增強了其在即時檢測應用中的實用性[33]。為了進一步提高靈敏度并實現定量分析，將量子點（QD）標記技術應用于側向流動免疫層析檢測中以增強熒光信號。量子點微球（QDMs）具有多種有利特性，包括高熒光強度、窄發射光譜、寬激發范圍、良好的光穩定性以及良好的生物相容性[34]、[35]，這些特性共同有助于減少視覺解釋的錯誤并簡化結果分析[36]。

在這項研究中，我們開發了一種集成式的即時檢測平臺，結合了逆轉錄重組酶輔助擴增（RT-RAA）、CRISPR-Cas12a和基于量子點的側向流動條帶，通過并行檢測方法實現對三種主要豬腹瀉病毒（PEDV、PDCoV和PoRVA）的超靈敏和現場檢測。此外，還設計了一種便攜式智能手機熒光讀取器，以實現三種目標病毒的視覺和定量檢測。在檢測過程中，首先通過RT-RAA擴增目標核酸以生成足夠的DNA模板，然后CRISPR-Cas12a特異性識別并切割目標序列。隨后，將切割產物與稀釋緩沖液混合后應用于基于QDMs的側向流動條帶。最后，通過便攜式讀取器收集熒光信號，并通過智能手機應用程序進行病毒載量的定量分析。整個檢測過程在1小時內完成，靈敏度和特異性很高，檢測限低至1拷貝/μL。總之，該系統成本低廉、操作簡便，具有出色的分析性能，在資源有限的場合（如養豬場）具有巨大的應用前景。

基于RT-RAA和CRISPR/Cas12a的量子點熒光條帶檢測原理如圖1所示。首先，在40℃的等溫條件下使用RT-RAA試劑盒擴增目標核酸20分鐘。然后將擴增產物與Cas12a、crRNA和報告探針混合。crRNA特異性識別并結合目標DNA，激活Cas12a的轉切割活性，從而切割報告探針

本研究開發了一種簡化且快速的視覺檢測方法，用于豬腹瀉病毒的檢測，為傳統的多重RT-PCR檢測方法提供了有效的替代方案。通過結合等溫擴增、基于CRISPR/Cas12a的目標識別和基于量子點的熒光側向流動檢測，所開發的系統克服了傳統核酸檢測方法的局限性，簡化了操作流程，并保持了高靈敏度和特異性。

趙一然：撰寫——原始草案、驗證、軟件開發、方法學設計、實驗設計、數據分析、概念化。劉飛：撰寫——審稿與編輯、項目監督、資源協調、資金爭取、概念化。吳明輝：撰寫——審稿與編輯、項目監督、資金爭取、概念化。單彥凱：項目監督、軟件開發。陳婷軒：撰寫——審稿與編輯。毛瑞琦：軟件開發。

作者聲明沒有已知的競爭性財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。

本工作得到了中國國家重點研發計劃（2023YFD1800501）、中央高校基本科研業務費（090-ZJ25195024）、國家自然科學基金（22304071）以及江蘇省研究生研究與實踐創新計劃（SJCX25_0281）的支持。