《Analytica Chimica Acta》：Rapid Detection of Measles Virus RNA from Clinical Specimens by Using RT-LAMP Coupled with CRISPR/Cas12b via Fluorescence and Lateral Flow Biosensor Readouts: A Proof-of-Concept Study
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麻疹病毒快速檢測技術LAmCaD：基于RT-LAMP與CRISPR-Cas12b的雙模診斷平臺研究，通過自純化AapCas12b實現無需復雜設備的高特異性檢測（靈敏度10^5 copies），適用于資源有限地區，助力全球麻疹消除。
作者：Shivani Sharma、Shibendra Kumar Lal Karna、Sudhir Khanal、Yuba Raj Pokharel
印度新德里南亞大學生命科學與生物技術學院
摘要
背景
快速確認疑似病例對于控制麻疹至關重要，但現有方法需要復雜的實驗室設施。我們開發了一種名為LAmCaD的新型診斷平臺，該平臺結合了環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification）和CRISPR-Cas12b分子剪刀（CRISPR-Cas12b），集成了快速核酸提取、RT-LAMP擴增以及自純化的AapCas12b蛋白，能夠在缺乏實驗室條件的環境中用于檢測麻疹RNA。
方法
LAmCaD基于熒光和側向流動生物傳感器兩種檢測方式。使用Vero/hSLAM細胞培養的麻疹病毒RNA對LAmCaD方法的分析靈敏度和特異性進行了評估，并通過患者樣本與標準RT-PCR方法進行了對比測試。同時，還評估了其對流行病學上重要的麻疹基因型D8、D4和B3的檢測能力。
結果
來自Alicyclobacillus acidiphilus的自純化蛋白AapCas12b具有強烈的順式（cis）和反式（trans）切割活性，從而無需依賴商業酶制劑。該平臺通過快速核酸提取直接使用臨床樣本，無需進行RNA純化步驟，即可直接用于RT-LAMP反應。單獨使用RT-LAMP的檢測靈敏度約為10^3個拷貝，而整個檢測流程可檢測到約10^5個拷貝的麻疹病毒（通過熒光檢測）或約10^4個拷貝的麻疹病毒（通過側向流動檢測）。診斷評估顯示靈敏度為64.00%，特異性為92.59%，陰性預測值為99.95%，總體準確率為92.56%。ROC曲線分析顯示AUC值為0.717，表明其具有較好的區分能力。該檢測方法與RT-PCR的結果具有中等程度的一致性（κ = 0.6），并能成功識別D8、D4和B3基因型。整個檢測過程耗時90分鐘。
結論
這一概念驗證性的LAmCaD平臺為開發一種成本低廉、可在現場使用的診斷測試奠定了基礎，無需依賴商業酶或復雜的樣本處理流程。該平臺有助于在資源有限或偏遠地區快速確認麻疹病例，從而為全球消除麻疹的目標做出貢獻。這項研究在世衛組織東南亞區域進行，尤其與該地區2023年的消除目標相關，有助于解決當前監測差距和樣本運輸挑戰等問題。
部分內容摘錄
引言
麻疹病毒（MeV）是一種單鏈負鏈RNA病毒，基因組大小約為15.9 kb，屬于Paramyxoviridae科的Morbillivirus屬。這種高度傳染性的病原體會導致急性呼吸道疾病，具有較高的發病率和死亡率，主要感染人類，極少傳播給非人類靈長類動物，通過空氣傳播，且沒有已知的動物宿主。一個感染者可將其病毒傳播給12-18人。
生物材料
本研究使用了兩類樣本：未經處理的臨床樣本（用于評估檢測方法的性能及潛在的生物抑制劑和基質效應），以及人工制備的樣本（如經過充分表征的對照樣本和合成樣本）。麻疹陽性臨床樣本、病毒分離株（基因型D8、D4和B3）以及rubella病毒分離株（基因型2B）均來自印度醫學研究委員會-孟買國家病毒學研究所。
LAmCaD檢測原理
該檢測系統通過兩階段擴增和檢測過程實現目標，結合了RT-LAMP的靈敏度和CRISPR-Cas12b的特異性。在第一階段，RT-LAMP擴增使用六個引物（F3、B3、FIP、BIP、LF和LB），這些引物能夠識別目標模板上的八個不同位點，在60-68°C的恒定溫度下進行40-60分鐘的擴增，從而產生多個目標序列拷貝。
討論
LAMP技術已成功應用于麻疹病毒基因組的檢測。Huang等人將重組酶聚合酶擴增（RPA）與LAMP結合在微流控平臺上用于檢測麻疹病毒。盡管這種RPA-LAMP微流控方法具有創新性，但仍存在一些局限性，如芯片制備復雜、多階段擴增過程繁瑣、設備依賴性強以及相對于簡單等溫方法適用性較低等問題。
結論
LAmCaD平臺成功實現了使用自純化的Cas12b蛋白、快速的5分鐘RNA提取過程及簡單設備，在90分鐘內完成麻疹RNA的檢測。該檢測方法具有高特異性（92.59%），能夠檢測多種基因型，并具備雙重檢測功能。該平臺所需的資本投入較低（每次反應成本約5-8美元），具有經濟可行性。
作者貢獻聲明
Shivani Sharma：撰寫初稿、數據可視化、驗證、軟件開發、方法設計、實驗設計、數據分析、概念構思。
Shibendra Kumar Lal Karna：數據可視化、驗證、方法設計、實驗設計。
Sudhir Khanal：項目監督、資金籌集。
Yuba Raj Pokharel：撰寫修訂稿、數據可視化、驗證、項目監督、軟件開發、方法設計、實驗設計、資金籌集、概念構思。
倫理聲明
所有臨床樣本的收集和使用均符合機構倫理指南，并獲得了相關人員的知情同意。該研究于2021年7月5日獲得南亞大學機構生物安全委員會（SAU-IBSC）和機構倫理委員會（SAU-IEC）的批準（文件編號：SAU/FLSB IIECI 2021 -01）。同時，也獲得了孟買國家病毒學研究所（NIV-Mumbai）和ICMR機構倫理委員會的批準（證書編號：……）。
相關附件
附件中包含詳細的實驗信息和補充數據，包括生物材料規格及方法流程。關鍵內容包括麻疹病毒的培養和純化步驟（圖S1–S2）、AapCas12b蛋白純化方案、RT-LAMP引物設計及篩選結果（圖S3–S8、表S1）。此外還提供了sgRNA序列（表S2和S3）、蛋白質表達和純化數據（圖S9等）。
利益沖突
作者聲明不存在任何利益沖突。
資金支持
本研究得到了世界衛生組織（WHO）的資助（項目編號：202211213538-1/采購訂單：202814880-1/單位參考：IVD/CDS/SEARO）。
利益沖突聲明
Yuba Raj Pokharel表示獲得了世界衛生組織的財務支持，并與南亞大學存在雇傭關系。其他作者聲明不存在可能影響研究結果的財務利益或個人關系。
致謝
我們感謝南亞大學生命科學與生物技術學院提供的研究設施。同時，也非常感謝世界衛生組織東南亞區域辦事處（WHO-SEARO）在協調工作、聯系技術專家及試劑采購方面的幫助。此外，還要感謝Paul A Rota博士和Ahmed M. Kassem博士在整個研究過程中提供的專業技術指導。
