基因組編輯技術的發展使得我們能夠詳細研究各種動物、植物和微生物的基因功能（Carroll, 2014; Knott and Doudna, 2018; Ran et al., 2013）。在昆蟲中，基因組編輯通常是通過將CRISPR/Cas9等基因組編輯工具注入早期胚胎來進行的（Ahmed et al., 2025; Bassett and Liu, 2014; Bassett et al., 2013; Daimon et al., 2014）。由于昆蟲胚胎在注射時處于合胞胚階段，并且會發生表面切割，因此產生的G0（第0代）個體會成為攜帶野生型（wt）和多個突變等位基因混合物的基因鑲嵌體（Ahmed et al., 2025; Daimon, 2015; Daimon et al., 2014）。
一般來說，體細胞鑲嵌型的G0個體提供了一個評估目標基因非細胞自主功能的有用機會，而無需建立穩定的突變系（Ahmed et al., 2025; Daimon, 2015; Daimon et al., 2014; Zhang and Reed, 2017）。這種G0鑲嵌體方法允許在單一代內評估表型（Mazo-Vargas et al., 2022; Yoda et al., 2014; Zhang and Reed, 2016）。然而，對于許多項目來說，建立可遺傳的基因組編輯系仍然是必要的，因為基因固定的突變等位基因能夠支持詳細且可重復的表型分析。
先前的研究表明，當破壞那些其缺失會導致G0鑲嵌體致死的基因時，會遇到一個主要障礙（Daimon, 2015; Daimon et al., 2014; Sollazzo et al., 2024; Wu et al., 2018）。對于這類基因，G0個體的體細胞鑲嵌現象會阻止其發育成可育的成蟲，因為大多數或所有的G0個體都會因鑲嵌體致死表型而死亡。在產生高編輯效率的實驗條件下，這一難題尤為突出。盡管在研究非模式昆蟲的研究人員中這一點被廣泛認可（Daimon, 2015; Sollazzo et al., 2024; Wu et al., 2018; Zhang and Reed, 2017），但這個“G0致死問題”僅被間接提及，尚未建立通用解決方案。
在G0體細胞鑲嵌體分析中，人們采用了一種經驗性方法來處理與目標基因破壞相關的致死現象。例如，Zhang和Reed（2017）描述了降低注射的Cas9核糖核蛋白（RNPs）濃度可以減少蝴蝶的鑲嵌體致死性。此外，在家蠶Bombyx mori中，我們之前在嘗試建立抗變態轉錄因子基因Krüppel homolog 1（Kr-h1）的生殖細胞突變系時遇到了困難，因為所有的G0幼蟲都死于幼蟲-蛹期鑲嵌體，沒有存活的成蟲出現（Daimon et al., 2014）。后來，我們通過將轉錄激活因子樣內切酶mRNAs的注射混合物稀釋至1/100來建立了可遺傳的突變系（T.D.，未發表的結果）。盡管有這些觀察結果，但這種稀釋策略尚未經過系統測試。因此，目前尚不清楚它是否能夠可靠地支持從存活的G0成蟲中恢復可遺傳的突變。在沒有定量分析稀釋如何影響體細胞和生殖細胞編輯結果的情況下，這種稀釋方法仍然只是一種缺乏明確技術或理論基礎的實踐。
在本研究中，我們旨在提供技術和概念基礎，以克服昆蟲基因組編輯中的G0鑲嵌體致死性。我們研究了稀釋Cas9 RNP注射混合物是否可以減輕G0的致死性，并使下一代能夠恢復生殖細胞突變。為此，我們使用了煙草切根蟲Spodoptera litura作為模型物種，并針對鑲嵌體致死基因Met1（Methoprene-tolerant 1）進行實驗，該基因編碼一種幼蟲激素（JH）受體（Daimon et al., 2015; Konopova and Jindra, 2007）。通過系統地稀釋Cas9 RNP注射混合物，我們評估了稀釋對G0存活率、體細胞鑲嵌表型和生殖細胞突變率的影響。此外，我們還定量評估了G0體細胞和生殖細胞中的編輯效率，以確定稀釋如何調節編輯結果。
我們的結果清楚地表明，稀釋可以減輕G0的鑲嵌體致死性。稀釋增加了能夠存活到成年并成功將編輯等位基因傳遞給后代的G0個體的比例。隨著稀釋程度的增加，體細胞和生殖細胞的編輯效率都下降了，這表明稀釋可以在減少致死性體細胞編輯的同時保持足夠的生殖細胞編輯，從而確保可遺傳的傳遞。綜上所述，我們發現DIL-CRISPR（一種通過稀釋CRISPR/Cas9注射混合物創建的方法）提供了一種簡單、實用且可推廣的方法來解決G0致死性問題。
