《The Crop Journal》：CRISPR/Cas9 knockout of
BnaA01.AP2 increases seed oil content with no yield penalty in
Brassica napus L
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本研究針對(duì)甘藍(lán)型油菜(Brassica napus L.)種子油產(chǎn)量提升的育種難題，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)特異性敲除BnaA01.AP2基因，發(fā)現(xiàn)該操作可顯著提高種子產(chǎn)量和含油量，從而提升總油產(chǎn)量，且未發(fā)現(xiàn)其他農(nóng)藝性狀負(fù)面影響。研究進(jìn)一步闡明BnaA01.AP2通過(guò)直接抑制BnaA09.WRI1、BnaA03.BCCP1、BnaA09.L1L和BnaC09.L1L等關(guān)鍵基因表達(dá)，間接調(diào)控糖酵解、脂肪酸生物合成和三酰甘油組裝通路，進(jìn)而抑制油脂積累的分子機(jī)制。該研究為油菜高油育種提供了重要基因資源和理論依據(jù)。
油菜是世界上第三大油料作物，其種子油產(chǎn)量由種子產(chǎn)量和含油量共同決定。然而，這兩個(gè)關(guān)鍵農(nóng)藝性狀往往存在負(fù)相關(guān)關(guān)系，同步改良難度極大。以往研究表明，同時(shí)抑制甘藍(lán)型油菜中四個(gè)BnAP2旁系同源基因會(huì)導(dǎo)致花器官發(fā)育異常和種子減產(chǎn)，這嚴(yán)重限制了其在育種中的應(yīng)用。因此，解析特定BnAP2旁系同源基因的功能，尋找在不影響產(chǎn)量的前提下提高含油量的靶點(diǎn)，成為油菜遺傳改良的重要課題。
在這項(xiàng)發(fā)表于《The Crop Journal》的研究中，研究人員獨(dú)辟蹊徑，發(fā)現(xiàn)四個(gè)BnAP2旁系同源基因中，BnaA01.AP2在花組織中表達(dá)量最低，暗示其可能對(duì)花發(fā)育影響較小。基于此，他們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，在甘藍(lán)型油菜K407自交系中成功創(chuàng)制了BnaA01.AP2的純合突變體。
研究人員采用了多種關(guān)鍵技術(shù)方法：利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建基因敲除載體并轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜；通過(guò)氣相色譜分析種子脂肪酸組成和含量；利用RNA-seq技術(shù)分析發(fā)育種子（28天）的轉(zhuǎn)錄組差異；運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)、酵母單雜交(Y1H)和雙熒光素酶報(bào)告基因(Dual-LUC)等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子與下游靶基因的直接調(diào)控關(guān)系。
研究結(jié)果如下：
3.1. BnAP2旁系同源基因的序列特征
研究人員從甘藍(lán)型油菜K407自交系中克隆了四個(gè)BnAP2旁系同源基因。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，BnaA01.AP2與其他三個(gè)旁系同源基因親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，暗示其可能發(fā)生了功能分化。
3.2. BnAP2旁系同源基因的表達(dá)模式分析
表達(dá)模式分析顯示，四個(gè)BnAP2基因在萌發(fā)種子、根、莖和擴(kuò)展葉片中表達(dá)模式相似，在花中高表達(dá)，但BnaA01.AP2在花中表達(dá)量極低。所有基因在發(fā)育種子中均高表達(dá)，尤其在油脂活躍積累期（20-30天），提示它們可能參與調(diào)控種子油脂積累。亞細(xì)胞定位表明四個(gè)BnAP2蛋白均定位于細(xì)胞核，酵母轉(zhuǎn)錄自激活實(shí)驗(yàn)證實(shí)它們均具有轉(zhuǎn)錄激活活性。
3.3. CRISPR/Cas9產(chǎn)生的BnaA01.AP2無(wú)效突變體表現(xiàn)出增強(qiáng)的種子油產(chǎn)量
成功獲得兩個(gè)BnaA01.AP2純合突變體（L1和L2）。與野生型相比，突變體花器官形態(tài)正常，但植株增高、角果增寬、單粒種子重量顯著增加，從而導(dǎo)致種子產(chǎn)量提升。更重要的是，突變體種子總脂肪酸含量顯著提高，其中棕櫚酸(C16:0)比例增加。最終，種子油產(chǎn)量顯著提高，且未檢測(cè)到其他農(nóng)藝性狀的負(fù)面影響。在L1突變體背景中過(guò)表達(dá)BnaA01.AP2可完全回復(fù)突變體的表型至野生型水平，證實(shí)表型變化確實(shí)由BnaA01.AP2突變引起。
3.4. ‘K407’和L1植株發(fā)育28天種子中的差異表達(dá)基因
對(duì)28天發(fā)育種子進(jìn)行RNA-seq分析，共發(fā)現(xiàn)8196個(gè)差異表達(dá)基因(DEG)，其中4307個(gè)上調(diào)，3889個(gè)下調(diào)。KEGG富集分析表明這些DEGs富集于脂肪酸生物合成和代謝等通路。32個(gè)與油脂合成相關(guān)的DEGs被重點(diǎn)關(guān)注，包括多個(gè)已知正調(diào)控（如BnaA09.WRI1, BnaA09.L1L）或負(fù)調(diào)控（如BnaC04.WRKY6, BnaA09.TT8）油脂積累的轉(zhuǎn)錄因子及其下游結(jié)構(gòu)基因。RT-qPCR驗(yàn)證了這些基因的表達(dá)變化，并且其在互補(bǔ)植株中表達(dá)恢復(fù)至野生型水平。
3.5. BnaA01.AP2在甘藍(lán)型油菜發(fā)育種子中直接靶向BnaA09.WRI1、BnaA03.BCCP1、BnaA09.L1L和BnaC09.L1L
通過(guò)酵母單雜交(Y1H)和電泳遷移率變動(dòng)分析(EMSA)證實(shí)BnaA01.AP2能特異性結(jié)合AT-rich motif (TTTGTT/AACAAA)。利用ChIP-qPCR、Y1H和Dual-LUC實(shí)驗(yàn)，研究人員證明BnaA01.AP2蛋白在體內(nèi)外能直接結(jié)合BnaA09.WRI1、BnaA03.BCCP1、BnaA09.L1L和BnaC09.L1L的啟動(dòng)子區(qū)域，并抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄活性。
綜上所述，本研究得出結(jié)論：BnaA01.AP2是甘藍(lán)型油菜種子油脂積累的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的BnaA01.AP2特異性敲除，能夠通過(guò)直接抑制下游關(guān)鍵油脂合成基因（如WRI1, L1L, BCCP1），并間接影響更廣泛的油脂合成通路，從而在不引起花器官缺陷和產(chǎn)量損失的前提下，協(xié)同提高種子產(chǎn)量和含油量，最終顯著提升種子油產(chǎn)量。
這項(xiàng)研究的創(chuàng)新性和重要意義在于：首次明確了BnaA01.AP2這一特定旁系同源基因在調(diào)控油菜種子油脂積累中的獨(dú)立功能，避免了同時(shí)敲除多個(gè)旁系同源基因帶來(lái)的負(fù)面效應(yīng)；系統(tǒng)解析了BnaA01.AP2通過(guò)直接和間接方式調(diào)控油脂合成網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)制；創(chuàng)制的BnaA01.AP2突變體是寶貴的育種材料，為通過(guò)生物技術(shù)手段培育高油油菜新品種提供了高效的基因靶點(diǎn)和優(yōu)異的種質(zhì)資源，對(duì)保障植物油供給安全具有重要應(yīng)用前景。
