《Materials Today Bio》：NIR-II Biomimetic Nanoplatform Optogenetic CD274 Editing of HNSCC Immunogenicity for Enhanced Photoimmunotherapy
編輯推薦：
本研究針對頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）免疫原性低、T細胞浸潤不足的難題，開發了一種α-LDLR修飾的紅細胞膜仿生納米平臺（ARPC），該平臺可遞送NIR-II光熱聚合物和CRISPR/Cas9質粒，通過NIR-II激光照射誘導熱應激上調Hsp70，進而啟動CRISPR/Cas9對CD274基因進行編輯，同時溫和光熱療法誘導免疫原性細胞死亡（ICD），增強CD8+T細胞浸潤，實現了高效的光免疫聯合治療，為克服HNSCC低免疫源性提供了新策略。
頭頸鱗狀細胞癌（HNSCC）是全球第六大常見癌癥，約占頭頸部腫瘤的90%。盡管免疫檢查點阻斷（ICB）療法在HNSCC治療中取得了顯著突破，但腫瘤固有的低免疫原性微環境和有限的T細胞浸潤嚴重限制了其療效。特別是HNSCC常表現為"冷腫瘤"特征，缺乏足夠的T細胞浸潤和免疫抑制性微環境，導致對ICB療法的反應不佳。此外，目前針對CD274（PD-L1）的單克隆抗體雖然已成為多種癌癥的標準治療，但由于CD274在正常組織中廣泛分布，其廣泛阻斷可能導致嚴重的免疫相關炎癥反應，如免疫性肺炎、心肌炎和甲狀腺功能減退等，嚴重影響ICB治療的臨床效果。
針對這些挑戰，浙江人民醫院康復醫學中心的研究團隊在《Materials Today Bio》上發表了一項創新性研究，開發了一種近紅外二區（NIR-II）光遺傳學CRISPR/Cas9納米平臺，通過編輯CD274基因來增強HNSCC的免疫原性，實現高效的光免疫治療。該研究巧妙地結合了仿生納米技術、光遺傳學控制和基因編輯技術，為克服HNSCC的低免疫原性提供了一種新穎的治療策略。
研究人員采用了幾項關鍵技術方法：首先構建了α-LDLR（低密度脂蛋白受體抗體）修飾的紅細胞膜仿生納米載體，用于包裹NIR-II光熱聚合物和Hsp70啟動子驅動的CRISPR/Cas9質粒；利用NIR-II激光（1060 nm）照射觸發溫和光熱療法（MPTT），誘導熱休克蛋白70（Hsp70）表達，進而啟動CRISPR/Cas9系統對CD274基因進行編輯；通過體外細胞實驗和體內小鼠模型（包括皮下移植瘤和原位喉癌模型）評估納米平臺的靶向性、基因編輯效率和抗腫瘤效果；采用全基因組測序分析評估基因編輯的特異性和安全性。
制備和表征ARPC
研究人員首先通過Western blot分析了26種癌癥類型中CD274的表達情況，確認其在HNSCC中的高表達。隨后設計了針對CD274的sgRNA，構建了Hsp70啟動子驅動的CRISPR/Cas9系統。制備的ARPC納米顆粒具有核殼結構，平均粒徑為313 nm，zeta電位為-12.9 mV。透射電鏡顯示納米顆粒呈球形，能譜 mapping證實了質粒DNA和光熱材料的成功包裹。ARPC在NIR-II激光照射下表現出良好的光熱轉換性能（光熱轉換效率為39.32%）和光穩定性，同時紅細胞膜修飾賦予了其良好的免疫逃逸能力。
細胞攝取和細胞毒性分析
流式細胞術和共聚焦顯微鏡顯示，由于α-LDLR受體的存在，ARPC在SCC7細胞中的內化效率最高。細胞毒性實驗表明，在沒有激光照射時，ARPC的細胞毒性較低，但在激光照射下能顯著誘導細胞凋亡，表現出濃度依賴性的細胞殺傷效果。
Hsp70啟動子驅動的CD274基因組編輯
研究證實，在NIR-II激光照射下，ARPC能有效激活Hsp70啟動子，使GFP表達水平達到58.6%，顯著高于PC（3.6%）和RPC（36%）。Western blot和免疫熒光顯示，隨著加熱時間的增加，Hsp70表達上調，CD274表達下調，Cas9蛋白表達增加。流式細胞術分析顯示，ARPC（+激光）組中CD274陰性細胞比例達到45.3%，表明CRISPR/Cas9系統成功編輯了CD274基因。
全基因組測序分析
通過對編輯樣本和對照樣本進行全基因組測序，研究人員評估了ARPC介導的基因編輯的特異性。結果顯示，對照組和ARPC組之間的單核苷酸多態性（SNP）差異較小，主要區別在于插入缺失（InDel）。通過Cas-OFFinder軟件預測全基因組范圍內的脫靶位點，發現在sgRNA同源區域內的潛在脫靶位點有限，證明了該系統的編輯特異性。
誘導免疫原性細胞死亡的能力
研究發現ARPC能有效誘導免疫原性細胞死亡（ICD），表現為鈣網蛋白（CRT）易位至細胞膜表面，高遷移率族蛋白B1（HMGB1）和ATP的釋放，以及I型干擾素的產生。這些損傷相關分子模式（DAMPs）能促進樹突狀細胞（DC）成熟和T細胞活化。
體外誘導ICD相關免疫細胞
通過將處理后的SCC7細胞與RAW264.7細胞、原代T細胞和樹突狀細胞共培養，研究發現ARPC（+激光）處理能顯著增加M1型巨噬細胞（CD80+CD86+）比例（5.0%）、CD8+T細胞比例（18.1%）和成熟DC比例（44.3%），表明ARPC能有效激活抗腫瘤免疫應答。
體內分布和抗腫瘤療效
體內實驗顯示，ARPC能有效靶向腫瘤組織，在注射后4小時即可在腫瘤部位檢測到明顯熒光信號。在0.75 W/cm2的激光照射下，腫瘤部位溫度可達到42°C，實現溫和光熱治療。ARPC（+激光）治療能顯著抑制腫瘤生長，提高小鼠生存率。
皮下腫瘤治療和CD274下調效果
在皮下移植瘤模型中，ARPC（+激光）治療組腫瘤體積最小，Western blot和免疫組化證實該組Hsp70表達上調，CD274表達下調。流式細胞術顯示ARPC（+激光）組CD274陰性細胞比例最高，TUNEL染色顯示細胞凋亡增加。
腫瘤部位的免疫原性細胞死亡效應
對腫瘤組織的分析顯示，ARPC（+激光）治療能顯著提高炎癥細胞因子（IL-1β、IFN-γ、TNF-α、IL-6）水平，誘導CRT表達上調和HMGB1核外釋放。流式細胞術分析顯示，ARPC（+激光）組中成熟DC比例（16.3%）、CD8+T細胞浸潤比例（32.0%）和巨噬細胞比例（36.8%）均顯著高于其他組。
淋巴結和脾臟中的炎癥細胞
類似地，在淋巴結和脾臟中，ARPC（+激光）治療也能顯著增加成熟DC、CD8+T細胞和巨噬細胞的比例，表明治療誘導的系統性免疫應答。
SCC7原位癌模型和ARPC的靶向特異性
在原位喉癌模型中，ARPC同樣表現出良好的腫瘤靶向能力，能在6小時內積累于腫瘤部位。雖然由于組織深度，達到理想治療溫度需要較長時間（9分鐘），但ARPC（+激光）治療仍能有效抑制腫瘤生長，改善小鼠生存狀態。
治療效力和生物相容性
在原位癌模型中，ARPC（+激光）治療能顯著抑制腫瘤生長，維持小鼠體重，組織切片顯示CD274表達下調，ICD相關標志物變化，免疫細胞浸潤增加。重要器官的H&E染色和血液生化指標分析表明ARPC具有良好的生物相容性。
這項研究成功開發了一種NIR-II光遺傳學CRISPR/Cas9納米平臺，通過α-LDLR介導的主動靶向和紅細胞膜賦予的免疫逃逸能力，實現了對腫瘤組織的特異性遞送。NIR-II激光激活的Hsp70啟動子引導的CRISPR/Cas9系統能永久性破壞CD274基因，同時溫和光熱療法誘導的ICD能觸發多方面的抗腫瘤免疫應答，包括促進DC成熟、增加M1/M2巨噬細胞比例、增強CD8+T細胞浸潤和增殖，以及減少免疫抑制細胞比例，從而重塑腫瘤免疫微環境。
雖然全基因組測序結果提供了ARPC介導的CD274基因編輯在短期內的生物安全性證據，但這種治療方法的長期效果和持久性仍需進一步驗證。未來研究需要對治愈小鼠進行長期隨訪，評估CD274破壞的持續性，檢測主要器官中潛在的脫靶修飾。此外，持續的免疫學監測對于識別可能的自身免疫表現以及確定CD274蛋白是否在復發腫瘤組織中再次表達也至關重要。
在臨床轉化方面，雖然本研究證明了NIR-II在皮下和原位HNSCC模型中精確光遺傳學激活的有效性，但將這種方法擴展到深部頭頸部惡性腫瘤（如下咽癌）仍面臨挑戰。NIR-II照射在致密組織中的有限穿透深度可能限制其在深部腫瘤區域的應用。未來的工作可能會探索臨床可行的遞送策略，包括內窺鏡或光纖激光照射的輔助，以及結合導光探針或光熱敏化劑以增強靶點的能量沉積。這些改進將有助于NIR-II光遺傳學基因編輯技術適應復雜的解剖位置，加強其在臨床腫瘤學應用中的轉化潛力。
總體而言，這項研究為HNSCC的有效ICB治療提供了一種創新的替代策略，為未來的腫瘤基因編輯療法帶來了希望。
