PIWI相互作用RNA（piRNAs）是一類長度在24-31個核苷酸之間的小非編碼RNA[1]。這些piRNAs最初被發現在生殖細胞中高度表達，并具有抑制轉座元件的能力，從而保持基因組的完整性[2]。這種沉默機制在保護基因組免受配子發生和生育過程中由轉座子引起的損傷方面起著重要作用[3]。此外，已有研究表明，piRNAs在體細胞中廣泛表達，并通過調節轉錄基因沉默、翻譯調控、mRNA穩定性、維持干細胞功能以及與多種蛋白質相互作用等過程發揮調控作用[4],[5]。特別是，piRNAs特異性地與Argonaute蛋白亞家族的PIWI蛋白結合，形成piRNA相關沉默復合體（piRISC），以執行生物學功能[6]。PIWI-piRNA通路在轉座元件的沉默、端粒保護復合體的組裝、胚胎發育的調控以及生殖細胞內基因組的穩定性和完整性的維持中具有重要意義[7],[8],[9]。新興證據表明，piRNAs與多種惡性腫瘤有關，包括胃癌[10],[11]、腎癌[12]、前列腺癌[13]、乳腺癌[14],[15]和結直腸癌[16]，以及多種疾病，如生殖系統[17]、心血管[18],[19]和神經系統[20]疾病。值得注意的是，piRNAs在人體體液中可被檢測到，在血清中尤其豐富[21]，且形式非常穩定[22]。因此，piRNAs是開發非侵入性診斷檢測方法的優秀生物標志物。

piRNAs的檢測傳統上使用微陣列分析[23]、下一代測序[24]和Northern印跡[25]等方法進行。然而，這些方法存在一些技術限制，如需要大量樣本、特異性較低和靈敏度中等。相比之下，聚合酶鏈反應（PCR）[26]提供了更高的piRNA定量靈敏度，但它需要復雜的逆轉錄步驟來從piRNA模板生成互補DNA。為了解決這些挑戰，基于熒光的新生物傳感平臺已被開發出來。這些先進的傳感器通常結合了核酸擴增技術，包括：雜交鏈反應（HCR）[27]、催化發夾組裝（CHA）[28]、滾環擴增（RCA）[29]。結合熒光技術和核酸擴增技術的生物傳感器已有效實現了對piRNAs的靈敏檢測。

CRISPR-Cas（規律間隔短回文重復序列，CRISPR相關蛋白）系統作為一種變革性技術，在基因編輯和分子診斷中發揮了重要作用，這歸功于其無與倫比的精確識別和特異性[30]。特別是CRISPR-Cas12a變體因其獨特的核酸酶特性而受到了大量研究關注。典型的CRISPR-Cas12a系統包括三個關鍵組成部分：CRISPR RNA（crRNA）、Cas12a效應蛋白和激活分子[31]。當crRNA識別到激活分子后，Cas12a復合體會發生構象激活，表現出對結合的激活分子的順式切割以及對非特異性單鏈DNA（ssDNA）分子的無差別切割活性[32],[33]。這種獨特的兩功能切割能力使Cas12a在分析應用中具有顯著優勢。目前的激活劑設計主要分為兩種形式：單鏈激活劑（ss-activators）[34]和雙鏈激活劑（ds-activators）[31]。然而，每種形式都有明顯的局限性：ss-activators的靶標特異性較差，而ds-activators通常需要PAM序列的存在，從而限制了其廣泛應用[35]。有趣的是，也有報道稱PAM序列對ds-activator的解旋貢獻很小，在隨后的切割過程中作用不大[32]。為了規避與PAM相關的限制，已經開發了幾種創新策略：(1) 在ds-activators中引入氣泡結構[36]或切口PAM序列[37]以降低雙鏈的結合親和力，從而便于其解旋和crRNA與目標鏈（TS）的結合；(2) 通過高溫或堿性溶液解旋ds-activators[38]，或用Lambda外切酶消化非目標鏈（NTS），然后以ss-activator的形式激活Cas12a；(3) 設計獨立于PAM的發夾結構ds-activators[40]，以激活Cas12a；(4) 實施帶有趾爪介導的鏈位移（TMSD）[35],[41]能力的粘性末端ds-activators，以識別crRNA并激活Cas12a；(5) 使用二硫蘇糖醇（DTT）來緩解PAM序列的限制[42]。

很少有研究人員嘗試直接使用未經修飾的無PAM ds-activators來激活Cas12a。因此，我們系統地研究了無PAM ds-activators用于Cas12a激活的可行性。實驗結果表明，無PAM ds-activators也可以激活Cas12a。比較分析顯示，在較低的激活劑濃度下，無PAM ds-activators的激活效率明顯低于含PAM的激活劑，而在較高激活劑濃度下這種差異減小。為了彌補激活效率的差異，我們開發了一種新的擴增策略，其中通過Klenow Fragment（KF）聚合酶介導的延伸，在NTS上連續再生無PAM ds-activators。這種方法使無PAM ds-activators能夠達到與含PAM變體相當的激活效率。為了進一步提高無PAM CRISPR-Cas12a系統的檢測靈敏度，通過將TMSD與引物延伸擴增結合，建立了一種級聯信號放大方法。目前，CRISPR-Cas12a系統在piRNAs檢測中的應用仍然很少探索，盡管它們已被廣泛用于檢測microRNAs（miRNAs）等生物標志物。在這里，我們利用基于CRISPR-Cas12a的級聯信號放大技術超靈敏地檢測了乳腺癌生物標志物piRNA-36026，顯示出顯著的檢測能力提升，同時完全不受PAM序列要求的限制。