《Nature Communications》：A scalable two-step genome editing strategy for generating full-length gene-humanized mice at diverse genomic loci
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本研究針對傳統基因人源化技術難以實現大片段基因組替換的瓶頸，開發了名為TECHNO的雙步CRISPR/Cas9同源重組技術。該策略通過胚胎干細胞連續編輯成功將超過200 kbp的人類基因組片段精準插入小鼠基因座，在c-Kit、APOBEC3簇和CYBB等模型中重現人類基因的組織特異性表達和剪切模式，并成功構建慢性肉芽腫病（CGD）疾病模型。該方法為人類基因功能研究和疾病機制解析提供了高效平臺。
在生物醫學研究中，小鼠因其與人類基因高度同源而成為不可或缺的模型生物。然而，物種間非編碼區和調控元件的差異常導致基因表達模式不同，限制了小鼠模型在模擬人類生物學過程中的應用。全長度基因人源化（FL-GH）通過完整替換小鼠基因座為人類同源序列，有望解決這一難題，但傳統技術受限于DNA插入片段大小、復雜操作流程和特殊材料需求，難以實現超過10 kbp的大片段精準替換。
針對這一挑戰，日本東京大學醫學科學研究所的田口淳平（Jumpei Taguchi）團隊在《Nature Communications》發表研究，提出名為TECHNO（Two-step ES Cell-based HumaNizatiOn）的雙步基因組編輯策略。該技術通過胚胎干細胞（ES細胞）中連續兩次CRISPR/Cas9介導的同源重組，成功實現長達205 kbp人類基因組片段的精準敲入，并證明人源化基因可重現人類組織特異性表達和功能。
關鍵技術方法
研究采用雙步編輯策略：第一步通過CRISPR/Cas9核糖核蛋白（RNP）靶向切除目標基因座，并插入含人類基因同源臂的耐藥表達框；第二步利用細菌人工染色體（BAC）攜帶完整人類基因組片段，通過同源重組實現大片段敲入。實驗使用C57BL/6、BALB/c等多品系小鼠ES細胞，通過流式細胞術、RNA測序（RNA-seq）、熒光原位雜交（FISH）和免疫印跡等技術驗證敲入效率與基因功能。
研究結果
1. Rosa26基因座敲入全長人類c-KIT基因組區域
研究首先在Rosa26安全位點驗證策略可行性，將約100 kbp的人類c-KIT（hKIT）基因組區域成功敲入小鼠ES細胞。實驗顯示，Cas9-RNP輔助下敲入效率達30.2%，且多數克隆為單拷貝整合。免疫熒光證實hKIT蛋白在ES細胞中表達，表明人類基因可在小鼠細胞中正常翻譯。
2. 小鼠c-Kit基因座的全長人源化
研究人員進一步將小鼠c-Kit基因座替換為人類同源序列。當使用3 kbp同源臂時，敲入效率提升至10%以上。人源化小鼠存活率符合孟德爾遺傳規律，且hKIT基因在睪丸、肺等組織中呈現與人類相似的表達模式。盡管部分純合子小鼠出現貧血和睪丸縮小，但其精子仍能通過體外受精（IVF）產生可育后代，證明人源化c-KIT可部分替代小鼠基因功能。
3. 超過200 kbp的APOBEC3基因簇人源化
人類APOBEC3基因簇包含7個串聯基因，全長超過200 kbp。研究在BALB/c和C57BL/6N ES細胞中分別實現15.2%和10.6%的敲入效率，且無頭尾串聯插入。RNA-seq分析顯示，人源化小鼠肺和脾臟中所有7個人類APOBEC3基因均表達，且表達譜與人類組織高度相關。值得注意的是，相鄰基因Cbx6在肺中表達下調，提示大片段替換可能影響鄰近基因調控。
4. 人源化等位基因疾病建模
研究還將X連鎖CYBB基因人源化，并引入慢性肉芽腫病（CGD）相關突變（T458G和A461△）。人源化CYBB在肺巨噬細胞中特異性表達，而突變型hCYBBMut小鼠的粒細胞在PMA刺激下無法產生活性氧（ROS），成功模擬CGD的免疫缺陷表型。
結論與意義
TECHNO技術通過標準化分子生物學試劑和商業化BAC庫，實現了93%人類基因的理論人源化范圍。該平臺不僅克服了傳統方法對特殊酶系統或長同源臂的依賴，還首次在多小鼠品系中實現>200 kbp片段的高效敲入。人源化基因在體內重現人類剪切異構體和組織特異性表達，并支持配體-受體互作、免疫應答等生理功能研究。未來結合堿基編輯或引物編輯技術，可直接在活體小鼠中引入疾病相關突變，為遺傳病機制研究和藥物開發提供更精準的模型。
