《Analytica Chimica Acta》：Thermosensitive Hydrogel-Enhanced RPA-CRISPR/Cas12a Biosensor for Ultrasensitive Detection of Methylated Loci in Breast Cancer ctDNA
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本研究開發了一種基于熱敏水凝膠的一管RPA-CRISPR/Cas12a檢測系統，結合甲基化敏感限制酶（MSRE），可特異性識別低豐度甲基化ctDNA，靈敏度達1×10^-8 ng/μL，較現有方法提升2倍，特異性達100%。
Jianxun Hou|Yingjie Wang|Weiguang Yuan|Yajie Gong|Yuanyuan Yu|Xuquan Qin|Hui Li|Youxue Zhang|Huawen Shi|Yanbo Chen|Xianyu Zhang
哈爾濱醫科大學附屬醫院，中國黑龍江省哈爾濱市150086
摘要
背景
乳腺癌組織與正常組織之間存在甲基化差異。腫瘤細胞釋放的甲基化循環腫瘤DNA（ctDNA）為使用甲基化ctDNA進行乳腺癌液體活檢提供了基礎。然而，至今在ctDNA中檢測低豐度甲基化位點仍然是一個重大挑戰。現有的單管檢測系統無法避免CRISPR/Cas12a切割導致的靶標耗竭，從而降低了檢測靈敏度。
結果
本研究開發了一種基于溫敏水凝膠的單管RPA-CRISPR/Cas12a檢測系統，結合了甲基化敏感的限制性內切酶（MSRE），用于檢測乳腺癌ctDNA中的特定甲基化位點。該方法首次實現了在單管內同時進行空間分離和反應階段之間的連接，且溫敏水凝膠對兩種系統均無抑制作用。該系統能夠特異性識別甲基化靶標分子，檢測限（LOD）低至1×10-8 ng/μL（約70個拷貝/μL），性能優于現有的甘油增強型單管反應系統。該方法能夠區分低至0.05%的甲基化片段，靈敏度是金標準甲基化特異性定量PCR（Methylight）的兩倍。使用該方法對15名臨床患者的腫瘤組織和配對血漿ctDNA進行檢測，顯示靈敏度和特異性均達到100%。
意義
這種新型的高靈敏度、高效且便攜的檢測方法通過溫敏水凝膠介導的單管相分離技術，創新性地解決了傳統RPA-CRISPR/Cas12a系統中CRISPR/Cas12a切割導致的靶標耗竭問題。它為準確檢測低豐度甲基化循環腫瘤DNA（ctDNA）提供了新的技術途徑，將顯著提升乳腺癌液體活檢的水平，并為乳腺癌的診斷和鑒別診斷提供有力支持。
引言
乳腺癌（BC）是全球女性中發病率最高的惡性腫瘤[1]。目前，乳腺癌的篩查方法主要依賴于成像技術，這嚴重限制了早期病變甚至癌前病變的檢測率。DNA甲基化在癌前病變階段就開始了[2,3]。DNA甲基化的異常變化被視為癌癥早期診斷、預后和治療監測的潛在生物標志物[4]。基因組甲基化水平受環境和遺傳因素的影響，并表現出區域性和種族特征[5]。循環無細胞基因組圖譜（CCGA）研究顯示，甲基化無細胞DNA（cfDNA）預測乳腺癌的敏感性為30.5%[6]。甲基化ctDNA可以識別預后不良的癌癥類型，提供預后信息，并對高度侵襲性的癌癥類型具有更高的敏感性[7]。
通過不同方法的自由組合，可以開發多種甲基化DNA檢測方法，用于識別或獲取甲基化DNA位點、核酸擴增方法和檢測原理。亞硫酸鈉處理[8,9]和TET酶轉化[10]涉及復雜的程序和較長的處理時間。特別是亞硫酸鈉處理會導致DNA顯著降解，從而影響后續的陽性檢測率。甲基化DNA結合蛋白方法[11]無法在單堿基水平上檢測甲基化；相反，它更適合評估特定DNA區域的甲基化狀態。MSRE方法[12]對堿基甲基化具有高敏感性，能夠實現特異性切割[13]，并允許在單堿基水平上檢測甲基化DNA。
目前，多種等溫擴增技術已與CRISPR/Cas12a技術結合，用于高靈敏度檢測核酸樣本。其中，重組酶聚合酶擴增（RPA）[14,15,16]的操作要求較低（37–42 °C，15分鐘），且不需要昂貴的大型PCR設備——這些特性使其特別適合與分子診斷工具CRISPR/Cas12a結合用于即時檢測（POCT）[17,18]。盡管直接混合兩種反應系統可以減少氣溶膠污染，但可能會過早激活CRISPR/Cas12a的高效切割活性。這種激活會導致RPA擴增模板過度消耗，從而降低檢測系統的靈敏度。目前，已經開發出多種方法來解決這一限制：Wang等人[19]構建的Cas12aVDet檢測平臺在RPA反應15分鐘后通過離心將Cas12a（預先放置在反應管內壁）加入RPA系統，但缺點是需要額外的離心步驟。一些添加劑如甜菜堿[20]和DMSO[21]已被證明可以加速RPA反應速率，添加L-脯氨酸[22]可以提高Cas12a/Cas13a的檢測能力；然而，這些方法都無法提高單管RPA-CRISPR/Cas12a系統的反應靈敏度。Yin等人[16]利用蔗糖的密度差異構建了動態水相反應（DAMR）系統，而Zhang[23]、Lu[24]及其同事利用甘油的粘度分離了RPA和CRISPR系統。盡管上述方法通過改變反應管中反應組分的排列在反應早期提高了檢測系統的效率，但蔗糖和甘油在反應后期會在系統中擴散，降低所有反應組分的擴散速率和分子碰撞頻率，Lin[25]的實驗結果證實，甘油在反應后期擴散會對RPA擴增反應產生抑制作用。Zhao等人將瓊脂糖凝膠與單管RPA-CRISPR/Cas12a反應結合使用。然而，瓊脂糖凝膠對CRISPR/Cas12a系統和RPA系統本身都有強烈的抑制作用[26]，表明其生物相容性較差。同時，瓊脂糖凝膠僅在45 °C時保持液態，難以在低溫下與CRISPR/Cas12a系統融合；相反，在高溫下融合會損害反應系統中的酶活性。因此，我們假設如果能夠在單反應管中空間分離RPA系統和CRISPR系統，并在整個反應過程中不對任一系統產生抑制作用，這種方法將優于現有方法，進一步提高單管RPA-CRISPR/Cas12a系統的檢測靈敏度。
一些溫敏水凝膠材料為我們的策略提供了有力支持。我們研究團隊的最新研究表明，這種混合水凝膠同時具有無細胞腹膜水凝膠的生物相容性和溫敏性，以及海藻酸鈉的機械強度[27]。然而，RPA-CRISPR/Cas12a系統中的Mg2+會與海藻酸鈉交聯，從而影響反應系統；因此，這種混合水凝膠不適合用于RPA-CRISPR/Cas12a系統。可塑的溫敏羥丙基殼聚糖（HPCH）水凝膠表現出優異的凝膠性能：其在37 °C下的凝膠時間少于18秒，同時也具有良好的生物相容性[28]。此外，其微米級孔隙允許各種反應組分在RPA-CRISPR/Cas12a系統中自由擴散。與上述溫敏水凝膠相比，純無細胞腹膜水凝膠制備過程簡單，也具有微米級孔隙，在4 °C時呈液態，并在37 °C時迅速凝膠。此外，腹膜水凝膠的生物衍生組分可以避免瓊脂糖凝膠的缺陷，如抑制核酸和蛋白酶活性。因此，在本研究中，我們構建了一種基于溫敏水凝膠的單管RPA-CRISPR/Cas12a檢測系統，結合了純無細胞腹膜水凝膠和MSRE，用于檢測乳腺癌ctDNA中的特定甲基化位點。
在本研究中，我們測試了由我們研究團隊先前開發的診斷預測模型，該模型包括4個乳腺癌生物標志物[29]。在這些生物標志物中，FEZF2基因的甲基化區域與Illumina 450K甲基化陣列上的捕獲探針cg20072171相對應。其hg19 chr3:62356944位置的甲基化區域包含適當的PAM（間隔序列），這使得可以設計用于Cas12a的crRNA。因此，選擇該甲基化位點作為本研究的檢測目標。
部分摘要
倫理聲明
本研究方案已獲得哈爾濱醫科大學倫理委員會的批準（批準編號：KY2022-65）。研究活動嚴格遵循國際人類研究保護標準，包括赫爾辛基宣言、貝爾蒙特報告、國際醫學科學組織理事會（CIOMS）倫理指南和國際協調良好臨床實踐（ICH-GCP）指南。已獲得書面知情同意。
MSRE結合RPA-CRISPR/Cas12a系統用于ctDNA甲基化位點檢測的可行性分析和反應組分優化
為了驗證MSRE結合RPA-CRISPR/Cas12a系統檢測ctDNA甲基化位點的可行性，我們首先研究了MSRE的切割效率和RPA的擴增效率。圖1A顯示了MSRE切割位點的示意圖及切割后產生的片段長度。RPA擴增產物被回收并通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析（圖1C）。結果顯示，RPA擴增產物的長度和
結論
乳腺癌的早期篩查和診斷對于改善患者預后至關重要。開發高靈敏度和特異性的液體活檢平臺以準確捕獲血漿中的低豐度甲基化ctDNA已成為精準腫瘤學領域的前沿方向[35,36,37,38]。本研究基于溫敏水凝膠的獨特性質，為RPA和CRISPR/Cas12a系統創造了空間隔離但反應相連的環境
CRediT作者貢獻聲明
Yajie Gong：方法學。Yuanyuan Yu：方法學。Xuquan Qin：資源。Hui Li：方法學。Youxue Zhang：方法學。Huawen Shi：方法學。Yanbo Chen：寫作 – 審稿與編輯。Xianyu Zhang：寫作 – 審稿與編輯、項目管理、資金獲取、概念構思。Jianxun Hou：寫作 – 原稿撰寫、方法學、數據分析。Yingjie Wang：方法學、數據分析。Weiguang Yuan：方法學
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文工作的競爭性財務利益或個人關系。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文工作的競爭性財務利益或個人關系。
致謝
Jianxun Hou和Yingjie Wang對這項工作做出了同等貢獻。本工作得到了國家自然科學基金（資助編號：82073410, 82272623）、Petrel研究基金[資助編號：JJMS2022-03]以及哈爾濱醫科大學附屬醫院的Nn10計劃（資助編號：2017-02）的支持。
