《Analytica Chimica Acta》：CADEM: Species-Level Detection of Mycobacterial cfDNA via CRISPR for Pulmonary Disease Diagnosis
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液體活檢中基于CRISPR/Cas12a和微流控的CADEM系統可同步檢測麻風分枝桿菌復合體、溶血性鏈球菌復合體和結核分枝桿菌，靈敏度較傳統PCR提高10-100倍，2小時完成樣本分析，解決傳統培養法耗時長和非結核分枝桿菌診斷困難的問題。
樸承吉（Seungil Park）| 庫邦漢（Bonhan Koo）| 金明圭（Myoung Gyu Kim）| 李恩英（Eun Yeong Lee）| 李孝珠（Hyo Joo Lee）| 羅延貞（Yeonjeong Roh）| 李敏珠（Minju Lee）| 白彩恩（Chae Eun Bae）| 李世元（Sei Won Lee）| 康英愛（Young Ae Kang）| 申勇（Yong Shin）
韓國首爾延世大學生命科學與生物技術學院生物技術系，郵編03722
摘要
背景
由結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）和非結核分枝桿菌（nontuberculous mycobacteria，NTM）引起的肺部感染由于癥狀重疊和治療方法不同，給臨床診斷帶來了顯著挑戰。特別是，準確鑒定NTM物種（如鳥分枝桿菌復合群（Mycobacterium avium complex，MAC）和膿腫分枝桿菌復合群（Mycobacterium abscessus complex，MABC）至關重要，因為這些物種的藥物敏感性特征與MTB有顯著差異。然而，傳統的基于培養的診斷方法耗時較長，且當前的分子檢測方法分辨率較低，且嚴重依賴痰液樣本。為了解決這些問題，利用細菌來源的循環游離DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）進行液體活檢提供了一種微創替代方案，而CRISPR/Cas12a技術則提供了檢測其微量水平的所需靈敏度。
結果
我們開發了CADEM（CRISPR-輔助檢測方法，該方法通過微流控技術富集分枝桿菌來源的cfDNA）。該診斷系統集成了微流控cfDNA富集、靶向擴增和基于CRISPR/Cas12a的檢測功能。微流控平臺能夠從大量臨床樣本中高效回收cfDNA，無需進行細胞裂解。優化的Cas12a–crRNA復合物能夠高度敏感且特異性地檢測MAC、MABC和MTB的特異性擴增產物，其靈敏度比終點PCR和基于探針的實時PCR高出10到100倍。在20個臨床樣本（7例陽性樣本和13例健康對照組）的驗證中，CADEM準確識別了所有MAC、MABC和MTB病例，且無假陽性結果。CRISPR檢測步驟在20分鐘內產生了清晰的熒光信號，結合富集和擴增步驟，整個流程在2小時內完成。
意義
CADEM提供了一種準確且高效的分子方法，可在物種水平上區分MAC、MABC和MTB，從而支持正確的診斷和治療。通過將微流控cfDNA富集與基于CRISPR的檢測相結合，CADEM能夠從液體活檢樣本中高效分析肺部疾病。該系統還兼容等溫擴增技術，為資源有限的場景下的即時檢測提供了可能。
引言
結核病（TB）和非結核分枝桿菌肺部疾病（NTM-PD）是由分枝桿菌屬細菌引起的肺部感染[1]。盡管兩者具有相似的微生物學特征，但在傳播方式、疾病進展和治療反應方面存在顯著差異[2]。盡管全球范圍內正在努力控制結核病，但它仍然是一個重大的公共衛生問題[3]。結核病由結核分枝桿菌（MTB）引起，通過人與人之間的傳播傳播，而NTM-PD則由不具有傳染性的環境分枝桿菌引起[4]。同時，在免疫功能低下和免疫功能正常的個體中，NTM-PD的發病率持續上升[5]。在結核病高發地區，即使AFB（抗酸桿菌）涂片顯微鏡檢查無法區分MTB和NTM，患者也常被假設為結核病患者并開始接受經驗性治療。這種診斷上的重疊導致NTM-PD病例經常被誤診和不當治療[6]。在NTM物種中，鳥分枝桿菌復合群（MAC）是最常見的，其次是膿腫分枝桿菌復合群（MABC）[7]。這些病原體在藥物敏感性和耐藥性方面與MTB有顯著差異，因此準確鑒定其物種至關重要[8]、[9]、[10]。基于培養的診斷方法仍然是結核病和NTM的金標準，但由于MTB需要2到6周才能生長，NTM-PD通常需要多次陽性培養才能確認感染并排除環境污染[2]、[9]、[11]、[12]，因此這些方法耗時且勞動強度高。為了解決這些問題，越來越多地采用分子診斷方法與培養方法結合使用，以提供更快、更可靠的診斷結果。
分子診斷方法對于快速準確地診斷分枝桿菌感染至關重要，這對于及時開始治療和有效控制疾病至關重要[9]、[14]。已經開發出嵌套實時PCR檢測方法，可以在短時間內檢測MTB及其耐藥性標志物[15]。然而，像Xpert這樣的廣泛使用的檢測方法僅適用于MTB檢測，無法識別NTM，這限制了其在臨床應用中的實用性。在MTB和NTB共感染的情況下，精確鑒定對于指導適當的治療尤為重要[16]、[17]。大多數傳統診斷工具還依賴于痰液樣本，而某些患者群體難以提供高質量的痰液[13]、[18]。作為替代方案，分析循環游離DNA（cfDNA）的液體活檢方法成為一種有前景的策略[19]、[20]、[21]。血漿或血清樣本是cfDNA的微創來源，cfDNA由宿主細胞或感染期間的病原體（如細菌）產生的短DNA片段組成[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]。cfDNA的一個關鍵優勢是無需進行細胞裂解即可分離。然而，大多數商業試劑盒的標準協議中仍包含裂解步驟[30]、[31]、[32]。盡管cfDNA具有很好的診斷潛力，但其臨床應用仍受到技術挑戰的限制，包括病原體來源cfDNA水平低、提取方法相關的PCR抑制以及基于裂解的協議產生的背景噪音[33]、[34]。因此，開發靈敏且穩健的檢測方法對于克服cfDNA診斷的技術挑戰至關重要。
為了提高基于cfDNA的檢測方法的診斷性能，CRISPR-Cas系統作為一種高靈敏度的分子檢測平臺應運而生。在其變體中，Cas12a因其雙重酶活性而被廣泛使用。當Cas12a識別到PAM（protospacer adjacent motif，通常為TTTV）序列時，它會引導CRISPR RNA（crRNA）與目標序列雜交，并切割目標DNA（順式切割），隨后切割單鏈DNA（反式切割），從而通過熒光報告基因的切割實現信號放大[35]、[36]。這種高靈敏度使得Cas12a能夠被少量的目標DNA激活[35]、[37]、[38]。基于這一機制，CRISPR檢測已應用于多種目標，包括細菌和病毒病原體[28]、[39]、[40]、[41]、[42]、單核苷酸多態性[43]、[44]、[45]以及血型基因分型[41]。然而，大多數現有的CRISPR檢測方法依賴于從裂解樣本中提取的DNA，這可能會引入背景噪音并降低分析精度。為了解決這個問題，最近的研究將CRISPR技術應用于通過液體活檢獲得的cfDNA。黃震（Zhen Huang）等人開發了一種用于檢測血漿中MTB來源cfDNA的CRISPR檢測方法[46]，林麗（Lin Li）等人隨后將其應用于MAC檢測[42]。盡管這些方法提高了靈敏度，但它們仍然依賴于基于裂解的提取流程，無法在同一診斷平臺上同時區分MAC、MABC和MTB。
在這項研究中，我們開發了一種新的診斷系統CADEM（CRISPR-輔助檢測方法，該方法通過微流控技術富集分枝桿菌來源的cfDNA，能夠同時區分MAC、MABC和MTB。該系統將微流控cfDNA富集、靶向擴增和基于CRISPR/Cas12a的檢測集成到一個高效的工作流程中，實現了高效且高靈敏度的分析。微流控芯片可以直接從臨床樣本中高效分離cfDNA，無需進行細胞裂解，減少了細胞碎片的背景干擾，并且即使是從大量樣本中也能實現高產量的回收。富集后的cfDNA使用針對MAC、MABC和MTB的特異性引物進行擴增，擴增產物被Cas12a–crRNA核蛋白（RNP）復合物識別，從而觸發熒光報告基因的反式切割，產生可讀信號。通過對20個臨床樣本（包括7例確診病例（2例MAC、1例MABC和4例MTB）和13例健康對照組）的驗證，CADEM準確識別了所有陽性病例，無假陽性結果，靈敏度和特異性均達到100%。因此，通過將無裂解的cfDNA富集、病原體特異性擴增和CRISPR檢測整合到一個2小時內完成的工作流程中，CADEM提供了一種準確、高效且微創的分枝桿菌肺部感染診斷方法。
材料與試劑
為了設計針對鳥分枝桿菌復合群（MAC）、膿腫分枝桿菌復合群（MABC）和結核分枝桿菌（MTB）的物種特異性檢測方法，我們從NCBI GenBank數據庫中獲取了位于16S和23S rRNA基因之間的內部轉錄間隔區（ITS）序列（表S1）。五個質粒包含了鳥分枝桿菌（M. avium）、細胞內分枝桿菌（M. intracellulare）、膿腫分枝桿菌（M. abscessus）的ITS區域
CADEM檢測方法的建立
我們建立了CADEM檢測方法（CRISPR-輔助檢測方法，該方法通過微流控技術富集分枝桿菌來源的cfDNA，實現了MAC、MABC和MTB的物種水平檢測（圖1）。該系統包括三個連續模塊：微流控cfDNA富集、目標特異性擴增和基于CRISPR/Cas12a的熒光檢測。臨床樣本在微流控芯片中用同功能化學交聯劑處理
結論
在這項研究中，我們開發了CADEM，這是一種集成了微流控富集、靶向擴增和CRISPR/Cas12a檢測的cfDNA診斷系統，能夠在2小時內識別和區分MAC、MABC和MTB。雖然大多數現有的分子檢測方法依賴于從裂解細胞中提取的DNA，并受到樣本類型、工作流程復雜性和背景污染的限制，但cfDNA提供了一種微創且無需裂解的替代方案
CRediT作者貢獻聲明
李孝珠（Hyo Joo Lee）：方法學、數據管理。羅延貞（Yeonjeong Roh）：方法學、數據管理。李敏珠（Minju Lee）：方法學、數據管理。白彩恩（Chae Eun Bae）：方法學、數據管理。李世元（Sei Won Lee）：資源支持。康英愛（Young Ae Kang）：寫作——審稿與編輯、監督、資源管理、概念構思。申勇（Yong Shin）：寫作——審稿與編輯、監督、項目管理、資金獲取、概念構思。樸承吉（Seungil Park）：寫作——初稿撰寫、方法學研究、數據分析。
致謝
本工作得到了韓國國家研究基金會（NRF）的資助，該基金會由韓國政府（MSIT）支持（項目編號：RS-2025-00513026、RS-2025-02192998和RS-2024-00341299）。
