《Crop Protection》：Crude sap-based CRISPR-Cas12a-assisted RT-RPA assay for specific detection of citrus yellow vein clearing virus in citrus
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柑橘黃脈澄清病毒（CYVCV）快速檢測新方法。本研究開發并驗證了基于CRISPR-Cas12a的RT-RPA技術，利用粗葉汁無需RNA提取即可在40-50分鐘內實現特異性檢測，靈敏度達10^-6稀釋度，成本較傳統RT-PCR降低1.4倍，適用于果園篩查和苗圃認證。
Rakesh Kumar | Susheel Kumar Sharma | Nishant Srivastava | Pooja Bhardwaj | Sini Kumari | Abhinav Rawat | Viswanathan Chinnusamy | Virendra Kumar Baranwal | Nitika Gupta
印度新德里-110012，ICAR-印度農業研究所，植物病理學系，植物病毒學高級中心
摘要
Citrus yellow vein clearing virus (CYVCV) 是一種全球范圍內新出現的柑橘病毒，常見于印度的柑橘果園中。早期檢測 CYVCV 對防止其通過繁殖材料傳播以及支持綜合病害管理至關重要。傳統的 RT-PCR 雖然可靠且被廣泛使用，但耗時較長，需要 RNA 提取，并依賴于復雜的實驗室設施，這限制了其在快速現場監測和大規模檢測中的應用。在這項研究中，我們開發并驗證了一種基于 CRISPR-Cas12a 的逆轉錄重組酶聚合酶擴增 (RT-RPA) 方法，使用粗葉汁作為模板，以實現快速、靈敏且序列特異性的 CYVCV 檢測。從 CYVCV 的 RNA 依賴性 RNA 聚合酶 (RdRp) 區域獲得的 241 bp RT-RPA 擴增子能夠被 Cas12a-crRNA 復合物特異性識別，從而激活熒光單鏈 DNA 報告基因的旁路切割，在 40-50 分鐘內產生穩定且明確的信號。通過定量熒光測量，該基于 CRISPR 的系統的分析靈敏度可達到 10^-6 稀釋度；而使用 UV 透射儀進行終點可視化則可達到 10^-3 稀釋度。在具有癥狀的柑橘田間樣本上的驗證顯示，感染植株顯示出強烈的熒光信號（最高可達 91,447 AU），而健康和陰性對照樣本則始終保持在基線水平。重要的是，感染樣本在 UV 光下的可見熒光進一步凸顯了該檢測方法在實地應用的潛力。與傳統 RT-PCR 相比，基于 CRISPR 的 RT-RPA 平臺每樣本的成本降低了約 1.4 倍，這一點通過詳細的試劑成本分析得到了證實。這些特性使該檢測方法成為一種穩健、用戶友好且可擴展的 CYVCV 診斷工具，具有在苗木登記、果園監測和認證項目中的巨大潛力。
引言
Citrus 種類是全球重要的園藝作物，其生產力和市場價值受到嫁接傳播病原體的嚴重限制，尤其是那些會降低植株活力、產量和果實品質的病毒和類病毒。其中，CYVCV 是一種屬于 Mandarivirus 屬（Alphaflexiviridae 科）的正鏈 RNA 病毒，最近被確認為一種檢疫相關威脅，會在感染植株中引起特征性的葉脈透明化、斑駁和黃化現象（Loconsole 等，2012）。CYVCV 最早在 1988 年在巴基斯坦的檸檬 (Citrus limon) 和酸橙 (C. aurantium) 中被發現（Catara 等，1993；Grimaldi & Catara，1996）。隨后在 1997 年，印度也報道了該病毒在多個柑橘品種中的存在，包括 Etrog 檸檬 (C. medica)（Loconsole 等，2012）。此后，該病毒在亞洲多個柑橘種植區被檢測到，包括中國、土耳其和伊朗（Kumar 等，2024）。最近，在美國加利福尼亞州也確認了 CYVCV 的存在，對柑橘產業構成了嚴重的檢疫風險（EPPO，2023；Sun & Yokomi，2023；Abrahamian 等，2024）。在南亞，最近的調查和病毒組學研究表明，商業品種如 Kinnow 柑橘 (Citrus reticulate) 中 CYVCV 的發病率正在上升（Pant 等，2018；Gupta 等，2024）。盡管傳統的 RT-PCR、RT-qPCR 和 ELISA 等診斷方法因其穩健性和靈敏度而成為主流，但由于它們依賴于實驗室設施、核酸提取和訓練有素的人員，這些方法在快速現場篩查和大規模認證項目中的應用受到限制（Zhou 等，2017；Gupta 等，2024）。高通量測序 (HTS) 改進了新病毒和混合感染的發現和流行病學監測，但其高昂的成本和基礎設施要求阻礙了其在現場診斷中的常規使用（Kumar 等，2024）。為了克服這些限制，開發了等溫擴增技術，尤其是重組酶聚合酶擴增 (RPA)，因為它們可以在恒定的低溫（通常為 37-42 °C）下擴增核酸，并能耐受粗植物提取物（Piepenburg 等，2006；Bhat 等，2022；Gupta 等，2024）。
RPA 適用于即時檢測，因為它在恒定低溫下快速運行。然而，與其他擴增方法一樣，RPA 和 LAMP 容易出現非特異性擴增現象，如引物二聚體和脫靶產物，尤其是在使用無探針檢測或側向流動格式時。除非結合序列特異性探針或 CRISPR-Cas 12/13 等確認工具，否則這些偽陽性結果可能會產生誤導（Ivanov 等，2020；Aman 等，2020；Ullah 等，2024；Warmt 等，2023）。基于 CRISPR 的檢測系統通過將擴增與高度序列特異性的引導 RNA 指導的核酸酶識別相結合來克服這一限制。基于 CRISPR-Cas12a 的檢測系統利用了 Cas12a 的獨特性質：CRISPR RNA (crRNA) 指導的 Cas12a 核酸酶識別目標后，會激活非特異性的（“旁路”）單鏈 DNase 活性。當 Cas12a-crRNA 復合物特異性結合到 RT-RPA 擴增過程中產生的互補雙鏈 DNA 目標上時，Cas12a 被激活并切割附近標記有熒光團和淬滅劑的單鏈 DNA 報告基因，從而產生可測量的熒光信號。這種依賴目標的旁路切割提供了比單純等溫擴增更高的序列特異性，從而減少了假陽性檢測，實現了快速、靈敏且高度特異性的病原體檢測（Chen 等，2018；Aman 等，2020）。特別是，Cas12a 表現出的目標激活的旁路單鏈 DNase 活性可以在正確擴增子的存在下僅切割熒光或側向流動報告基因，顯著提高了特異性，并簡化了熒光或視覺讀數的獲取（Chen 等，2018）。RPA-CRISPR (Cas12a) 組合已成功應用于多種植物病毒，證明了快速、靈敏且適用于田間檢測的工作流程（Aman 等，2020；Mahas 等，2021；Ramachandran 等，2021）。
基于我們之前開發的基于粗葉汁的 CYVCV RT-RPA 方法（Gupta 等，2024），該方法表現出高靈敏度和操作穩健性且樣本處理要求低，我們在這里建立了一種集成的 CRISPR-Cas12a 輔助 RT-RPA 工作流程，用于快速可靠的病毒檢測。該方法將 CYVCV RdRp 目標的等溫擴增與 Cas12a 介導的序列驗證和熒光報告基因切割相結合，從而減少了假陽性結果并在田間條件下提高了診斷信心。該檢測方法在 40 至 50 分鐘內提供結果，同時提供定量熒光讀數和 UV 透射儀下的終點可視化。通過結合速度、靈敏度和序列特異性，該平臺成為一種便攜且成本效益高的柑橘病毒檢測工具，適用于苗木登記、果園監測和認證項目。由于該方法使用粗葉汁作為模板，并依賴等溫擴增和基于 CRISPR 的檢測，因此無需常規實驗室設施和復雜的儀器即可實施。工作流程只需要一個便攜式干浴或加熱塊（37-40 °C）以及電池供電的加熱裝置進行孵育，再加上手持式 UV/藍光光源或緊湊型熒光計進行信號讀取。圖 1 展示了用于 CYVCV 檢測的 CRISPR-Cas12a 基礎 RT-RPA 方法的工作流程示意圖。
植物材料、核酸和粗葉汁制備
2025 年 8 月，從印度新德里 ICAR-印度農業研究所 (ICAR-IARI) 的果園中選取了四株 Kinnow 柑橘 (Citrus reticulate) 的幼葉，這些葉片表現出典型的葉脈透明化、斑駁和黃化癥狀。健康的溫室培育、種子繁殖的 Kinnow 植株葉片作為陰性對照。田間樣本中的病毒感染通過 RT-PCR 和測序得到確認（Kumar 等，2024）。
癥狀學和病毒確認
從 ICAR-IARI 的果園收集 Kinnow 柑橘樣本以檢測和分析 CYVCV。位于 Field 8B（28.643°N, 77.157°E）的植株表現出明顯的病毒癥狀，包括葉脈透明化、斑駁和葉片黃化。受感染的葉片通常在中脈和側脈處顯示出透明的葉脈透明化，伴有不規則的黃化斑塊和葉片活力下降（圖 2A-B）。
討論
本研究報道了結合 CRISPR-Cas12a 的 RT-RPA 平臺用于柑橘作物中 CYVCV 的序列特異性檢測。這些方法共同解決了 CYVCV 檢測中的關鍵挑戰。
在我們之前的研究中，RT-RPA 方法使用純化的 RNA、粗葉汁或克隆的質粒 DNA 作為模板，在 40 °C 下 25 分鐘內實現了 CYVCV 的快速擴增。該檢測方法能夠從 RNA 和粗葉汁制備物中檢測到低至 10^-7 稀釋度（相當于 0.1 pg/μl）的 CYVCV。
結論
本研究建立了一種快速、靈敏且成本效益高的基于 CRISPR-Cas12a 的 RT-RPA 方法，用于特異性檢測 CYVCV。該方法實現了低至 10^-6 稀釋度的熒光檢測，在 40 至 50 分鐘內提供明確的結果。通過將等溫擴增與 CRISPR 介導的檢測相結合，該平臺具有高特異性、快速周轉時間和對粗葉汁的兼容性，消除了對 RNA 提取的需求。
CRediT 作者貢獻聲明
Susheel Kumar Sharma：寫作 – 審稿與編輯、監督、資源管理、項目規劃、方法論、資金獲取、概念構思。
Nishant Srivastava：寫作 – 審稿與編輯。
Pooja Bhardwaj：寫作 – 審稿與編輯。
Sini Kumari：可視化、驗證、方法論。
Abhinav Rawat：可視化、驗證、方法論。
Viswanathan Chinnusamy：寫作 – 審稿與編輯、監督、資源管理、項目規劃。
未引用的參考文獻
歐洲和地中海植物保護組織，2023。
數據可用性
本研究中使用的序列可在 NCBI GenBank 數據庫中找到，訪問號為 OQ427642。
利益沖突
作者聲明不存在利益沖突。
涉及人類和動物的研究
本手稿中不包含涉及人類或動物的實驗。
資助
本研究得到了印度政府 生物技術部 在“組織培養植物國家認證系統下的病毒索引中心”項目（項目代碼：BT/AB/03/02/2021）的支持。此外，還得到了印度農業研究委員會 (ICAR) 和農業研究教育部 (DARE) 在印度農業研究所 (IARI) 主導項目“基因組編輯以改善資源利用”下的支持。
利益沖突聲明
? 作者聲明沒有已知的財務利益或個人關系可能影響本文所述的工作。
致謝
作者衷心感謝印度新德里 ICAR-印度農業研究所（ICAR）植物病理學系主任和主任提供的實驗室設施和持續鼓勵。
