植物與其生物脅迫因子（如病原體和害蟲）在長期共進(jìn)化過程中，形成了復(fù)雜的防御機(jī)制。植物天然產(chǎn)物（PNPs）作為專門化代謝物，在這一過程中扮演著關(guān)鍵角色。它們通常被劃分為兩類：組成型產(chǎn)生的植物抗毒素（phytoanticipins）和脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物抗毒素（phytoalexins）。隨著化學(xué)農(nóng)藥對非靶標(biāo)生物和生態(tài)環(huán)境的負(fù)面影響日益受到關(guān)注，PNPs作為環(huán)保型生物農(nóng)藥的替代品受到了廣泛重視。

植物的免疫系統(tǒng)通過識別病原體相關(guān)分子模式（PAMP）觸發(fā)模式觸發(fā)免疫（PTI），或通過細(xì)胞內(nèi)核苷酸結(jié)合富亮氨酸重復(fù)受體（NLR）識別病原體分泌的效應(yīng)子，從而引發(fā)效應(yīng)子觸發(fā)免疫（ETI）。防御性PNPs在此過程中通過直接毒性、信號傳導(dǎo)或結(jié)構(gòu)強(qiáng)化等多種機(jī)制發(fā)揮作用。例如，馬利筋中的卡烯內(nèi)酯（cardenolide）通過抑制昆蟲Na⁺/K⁺-ATP酶來抵御帝王蝶幼蟲；擬南芥中的芥酸酰胺（erucamide）通過靶向分泌系統(tǒng)抑制Pseudomonas syringae的毒力；水稻中的櫻花素（sakuranetin）則通過抑制昆蟲內(nèi)共生菌和真菌病原體Magnaporthe oryzae的網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用來提供防御。

值得注意的是，某些PNPs可能作為感病因子促進(jìn)病原體毒力。例如，大戟和蒺藜苜蓿的皂苷（saponin）缺陷突變體對灰葡萄孢（Botrytis cinerea）表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗性。因此，利用PNPs的策略也包含通過基因沉默等手段抑制此類感病因子。

利用防御性PNPs的主要策略包括三類：一是通過激活生物合成基因或其調(diào)控元件來增強(qiáng)或修飾內(nèi)源PNPs的產(chǎn)生；二是通過異源基因表達(dá)引入生物合成途徑，使作物能夠合成非天然的防御代謝物；三是外源施用PNPs作為傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的潛在替代品。

PNPs生物合成候選基因的鑒定與表征通常依賴于組學(xué)技術(shù)（基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)）與分析工具（共表達(dá)分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析/GWAS）的結(jié)合。PlantiSMASH、WGCNA和MEANtools等計算工具在此過程中發(fā)揮著重要作用。

單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）能夠提供細(xì)胞類型特異性的表達(dá)譜，已成為研究PNP生物合成、調(diào)控及其在植物體內(nèi)精確定位的有力工具。例如，在棉花中，scRNA-seq揭示了棉酚類萜烯、單萜和倍半萜類防御代謝物定位于分泌腺細(xì)胞（SGC），并鑒定了調(diào)控該防御性萜類網(wǎng)絡(luò)的SGC特異性轉(zhuǎn)錄因子（TF）。結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和scRNA-seq，研究人員在小麥中獲得了對 Fusarium 感染的細(xì)胞類型視角的免疫應(yīng)答，揭示了異黃酮、酚酰胺和苯并惡嗪酮途徑在韌皮部、綠色組織及葉鞘組織中的協(xié)同激活。新開發(fā)的mpXsn策略（結(jié)合大規(guī)模多重擾動與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)）成功揭示了抗癌藥物紫杉醇（taxol）前體——巴卡亭III（baccatin III）的若干生物合成基因。

多組學(xué)分析通過將酶編碼基因與其代謝產(chǎn)物相聯(lián)系，被證明是揭示PNP生物合成途徑的有效策略。例如，聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)分析鑒定了桃樹在受桃蚜（Myzus persicae）侵染后積累的九種三萜類化合物；對唇形科植物的聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組、基因組和代謝組分析揭示了參與抗昆蟲呋喃克羅烷（furanoclerodane）生物合成的細(xì)胞色素P450酶CYP76BK1同源基因的分布；在地涌金蓮（Musella lasiocarpa）中，多組學(xué)整合揭示了苯基菲蘭酮（PhPNs）的生物合成基因，并證明其具有抗尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的活性。

防御相關(guān)PNPs的生物合成途徑發(fā)現(xiàn)通常始于組學(xué)分析以鑒定候選基因，隨后進(jìn)行異源表達(dá)和代謝物表征，最終通過功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

近期研究發(fā)現(xiàn)，生物合成基因簇（BGCs）在植物防御中具有重要意義。例如，在面包小麥中鑒定并功能表征了病原體誘導(dǎo)的產(chǎn)生三萜類ellarinacin和黃酮類triticein的BGCs，以及產(chǎn)生未知二萜類化合物的簇；大麥中的一個BGC被證明指導(dǎo)了抗 Fusarium graminearum 的二萜類植物抗毒素——霍德丹（hordedane）的生物合成；另一個兩基因簇則介導(dǎo)了抗昆蟲和具有化感作用的生物堿——禾草堿（gramine）的生物合成，該過程涉及色氨酸的隱性氧化重排。

轉(zhuǎn)錄因子（TF）對代謝物生物合成基因的調(diào)控是一個活躍的研究領(lǐng)域。例如，水稻中的OsMYB1R是櫻花素生物合成的轉(zhuǎn)錄激活因子；過表達(dá)OsWRKY10可增強(qiáng)稻殼內(nèi)酯A（momilactone A）和B以及其它幾種二萜類植物抗毒素的積累，從而提高對稻瘟病的抗性；擬南芥中的AtWRKY70是系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）所必需的，該過程由植物天然產(chǎn)物N-羥基哌啶酸（NHP）介導(dǎo)。

在鑒定關(guān)鍵基因后，可應(yīng)用各種遺傳操作方法來調(diào)控內(nèi)源化合物的產(chǎn)生，包括RNA干擾（RNAi）和CRISPR/Cas基因組編輯。例如，在博落回（Macleaya cordata）中，利用CRISPR/Cas9敲除一個競爭支路酶，成功將代謝流導(dǎo)向抗菌生物堿血根堿（sanguinarine）；在芥菜中，多重CRISPR介導(dǎo)的基因組編輯產(chǎn)生了低種子、高葉片硫代葡萄糖苷（glucosinolate）水平且保持野生型防御能力的品系。

反之，CRISPR激活（CRISPRa）可用于激活/增強(qiáng)防御化合物的生物合成。例如，在擬南芥MYB12突變體背景下，通過多重CRISPRa激活六個類黃酮生物合成基因，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞類型特異性生產(chǎn)黃酮醇（flavonol）；在番茄中，CRISPRa靶向SlPAL2啟動子顯著上調(diào)了SlPAL2表達(dá)，從而增強(qiáng)了木質(zhì)素積累并賦予了對密歇根棍狀桿菌（Clavibacter michiganensis）的增強(qiáng)抗性。RNAi同樣可用于提高防御性PNP水平，例如穩(wěn)定沉默大豆中的GmJAZ1導(dǎo)致植物抗毒素glyceollin的更高積累。

合成生物學(xué)使得將完整或部分生物合成途徑引入不天然產(chǎn)生某種化合物的生物體成為可能。例如，將除蟲菊酯（pyrethrin）途徑從瓜葉菊（Tanacetum cinerariifolium）轉(zhuǎn)移到番茄腺毛中，實(shí)現(xiàn)了這種天然殺蟲劑的植物體內(nèi)合成；將來自抗馬鈴薯早疫病（Alternaria solani）的馬鈴薯野生近緣種Solanum commersonii中的兩個糖基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)�入感病的S. commersonii品系，誘導(dǎo)了新型四糖甾體糖生物堿（SGAs）的合成，從而增強(qiáng)了對早疫病和科羅拉多馬鈴薯甲蟲的抗性。

本氏煙（Nicotiana benthamiana）不僅常用于途徑發(fā)現(xiàn)，近期研究也致力于通過多種優(yōu)化策略將其作為PNPs的生產(chǎn)底盤。例如，通過（1）引入高性能苯丙氨酸解氨酶（PAL）同工型AtPAL2，（2）通過2A肽連接共表達(dá)GmCHS8和GmCHR5以增強(qiáng)代謝流，（3）使用花青素途徑阻遏蛋白AtMYB60重定向苯丙烷代謝，實(shí)現(xiàn)了大豆抗菌植物抗毒素異黃酮類glyceollin在本氏煙中的高產(chǎn)。有效的植物防御化合物異源工程化有時可能需要表達(dá)不止生物合成基因，如在N. benthamiana中工程化番茄來源的SGA所示。組裝SGA生物合成途徑需要表達(dá)具有葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶活性且充當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)支架的GAME15，該支架促進(jìn)幾種酶形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）相關(guān)的SGA代謝區(qū)室（metabolon），從而提高了途徑效率并限制了有毒中間體的積累。

作為替代方案，生物合成途徑可被工程化到快速生長的微生物中，在受控條件下合成防御化合物。與植物相比，微生物底盤具有生長快、細(xì)胞密度高、生物工藝成熟等優(yōu)勢，特別適合專門化代謝物的大規(guī)模生產(chǎn)。例如，具有抗昆蟲和抗病原體特性的植物抗毒素馬梅辛（marmesin）已在釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和大腸桿菌（Escherichia coli）中成功工程化，產(chǎn)量分別達(dá)到27.7 mg/L和203.7 mg/L。此外，具有精確調(diào)控功能的遺傳電路可以緩解代謝瓶頸，例如Park等人在酵母中為芳樟醇（linalool）合成設(shè)計了一個四啟動子電路，實(shí)現(xiàn)了40至500倍的動態(tài)范圍。

PNPs的化合物與途徑發(fā)現(xiàn)面臨諸多障礙。許多PNPs產(chǎn)量痕量，難以檢測；其合成往往僅在特定條件（如特定的生物脅迫或發(fā)育階段）下被觸發(fā)；且每種化合物通常僅是更廣泛的防御相關(guān)化合物集合的一部分，因此其缺陷不一定導(dǎo)致感病表型，這使得通過抗性基因的正向遺傳學(xué)方法發(fā)現(xiàn)其生物合成基因更具挑戰(zhàn)性。在PNP應(yīng)用于作物保護(hù)方面，還出現(xiàn)了一些非技術(shù)性挑戰(zhàn)，如高開發(fā)成本，以及與轉(zhuǎn)基因（GM）作物相關(guān)的公眾接受度低和監(jiān)管障礙。

新興技術(shù)正迅速推動PNPs作為植物防御工具的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用。AlphaFold已經(jīng)增進(jìn)了我們對植物-病原體相互作用的理解，并促進(jìn)了具有增強(qiáng)抗病性酶的設(shè)計，凸顯了其在途徑發(fā)現(xiàn)和工程化（包括為PNP途徑定制活性更高的酶）方面的潛力。同時，非靶向代謝組學(xué)不斷發(fā)展，MetaboLights、GNPS/MassIVE和MSnLib等數(shù)據(jù)庫的擴(kuò)展為更有效地表征PNP途徑鋪平了道路。PlantMASST和Modifinder等工具分別有助于檢測植物中代謝物的存在和預(yù)測結(jié)構(gòu)修飾。在外源PNP應(yīng)用方面，納米顆粒遞送系統(tǒng)展現(xiàn)出應(yīng)用前景，如載有印楝素（azadirachtin）的納米顆粒增強(qiáng)了黃瓜對棉蚜（Aphis gossypii）的抗性。

通過操縱PNP增強(qiáng)植物抗病性的可行性在幾十年前就已得到證明，近年來在植物防御化合物的發(fā)現(xiàn)、其生物合成的解析以及在模式和作物植物中工程化生產(chǎn)方面取得了顯著進(jìn)展。盡管有這些進(jìn)步，目前尚無商業(yè)栽培的作物品種是通過工程化植物專門化代謝物來增強(qiáng)抗病或抗蟲性的。相反，獲得監(jiān)管批準(zhǔn)的用于生物脅迫抗性的轉(zhuǎn)基因作物實(shí)例（盡管也很少）仍然集中于其他獲得性抗性機(jī)制，如表達(dá)病原體識別基因（R基因）、病毒外殼蛋白、細(xì)菌來源的蛋白質(zhì)毒素或靶向害蟲或病原體必需基因的RNAi。

鑒于豐富且 largely 未知的植物代謝組，發(fā)現(xiàn)新型生物活性防御化合物的潛力巨大。然而，要將植物化學(xué)防御的基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化為商業(yè)應(yīng)用，首先需要積累令人信服的田間試驗(yàn)證據(jù)，證明其持續(xù)有效性和農(nóng)藝性能。最終，這些成功可能為作物保護(hù)提供可行且可持續(xù)的替代或補(bǔ)充傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥的方案。