一種用于L-選擇素的超靈敏分裂適配體傳感器：將切割酶輔助的3D DNA行走器技術與CRISPR-Cas12a信號放大技術相結合
《Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry》：An ultrasensitive Split-Aptasensor for L-selectin: Integrating nicking enzyme-assisted 3D DNA Walker with CRISPR-Cas12a signal amplification
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時間：2026年01月16日
來源：Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 4.1
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L-selectin檢測新型熒光生物傳感器研發：采用分裂aptamer與CRISPR-Cas12a聯用及3D-DNA漫步技術，實現0.45 ng/mL超靈敏檢測，線性范圍10-1280 ng/mL，有效應用于人體血液樣本的定量分析，為炎癥和免疫相關疾病提供高精度診斷工具。
李周|焦賢偉|張玉婷|嚴長嶺
河南師范大學體育學院，中國河南省新鄉市453007
摘要
L-選擇素是一種白細胞粘附受體，在粘附級聯反應的早期階段起著關鍵作用，有助于白細胞在炎癥和免疫監視過程中遷移到周圍組織。臨床研究表明，L-選擇素是治療多種急性和慢性炎癥疾病的潛在候選藥物。闡明L-選擇素附近的細胞信號通路可能會為特定細胞類型或疾病提供獨特的治療方法。本研究描述了一種基于L-選擇素特異性裂解適配體的精確且靈敏的熒光生物傳感器的開發過程。該傳感器利用切割酶輔助的DNA行走技術和CRISPR-Cas12a實現雙信號放大。L-選擇素的校準曲線顯示檢測限為0.45 ng/mL，線性范圍為10至1280 ng/mL。熒光傳感器在人類血液樣本中有效檢測到了L-選擇素，取得了優異的結果。
引言
- L-選擇素是一種I型跨膜細胞粘附糖蛋白，主要表達在大多數循環白細胞表面[1]。通過對L-選擇素缺陷小鼠的研究，闡明了這種蛋白質在生理和病理狀態下的關鍵作用，尤其是在調節白細胞向外周淋巴結（例如幼稚T細胞）以及急性和慢性炎癥區域（例如單核細胞和中性粒細胞）的遷移方面[2]，[3]。臨床研究進一步表明L-選擇素是治療多種急性和慢性炎癥疾病的潛在靶點[4]，[5]。揭示L-選擇素下游的細胞內信號通路可能發現針對特定細胞類型或疾病的新型治療靶點[6]，[7]。因此，準確測定L-選擇素水平對疾病預防、診斷和靶向治療具有重要意義。
適配體能夠精確識別蛋白質、小分子、DNA、RNA和其他物質[8]，[9]，[10]。盡管最近開發的適配體為L-選擇素的檢測提供了有力工具，但大多數基于適配體的方法靈敏度有限且背景噪聲較大[11]，[12]，[13]。片段化適配體在缺乏目標時結構重塑能力受限，導致其信號響應不如完整的原始適配體強[14]，[15]，[16]。然而，片段化適配體在無目標情況下是非功能性的且獨立的，從而減少了假陽性和非特異性信號[17]，[18]。裂解適配體方法構建的傳感平臺具有出色的準確性、精確度和信噪比[19]，[20]，[21]。盡管如此，由于需要整合信號放大策略，這些檢測方法仍面臨靈敏度不足的挑戰[22]，[23]。實際上，將信號放大技術應用于大多數基于有機探針的熒光生物傳感器仍然非常具有挑戰性[24]，[25]，[26]。因此，探索一種能夠調節信號放大過程的新型熒光傳感平臺對于提高細胞內L-選擇素監測效率至關重要。
DNA行走器是一種高度敏感的核酸放大工具，能夠將化學能轉化為機械運動，并在分子尺度上執行類似機器的功能[27]。Nt.BsmAI是一種限制性內切酶，僅切割雙鏈DNA中的一個鏈。它可以作為切割酶輔助的DNA行走工具[28]。通過將化學振動轉化為機械運動，DNA行走器降解目標鏈，生成單鏈產物以實現信號放大和目標檢測[29]。納米顆粒的高表面積與體積比使得多個鏈可以整合到基于圓柱形核酸（SNA）的3D-DNA行走器中[30]，[31]。這顯著提高了區域內的DNA濃度，從而增強了行走效率和過程性[32]，并實現了快速且顯著的信號放大，從而提高了檢測靈敏度[33]。盡管取得了顯著進展，但現有系統大多未能達到所需的靈敏度[34]。準確的疾病診斷和疾病進展監測需要能夠在低濃度下檢測核酸。
本研究介紹了一種先進的超靈敏L-選擇素檢測方法，該方法結合了CRISPR/Cas12a熒光放大系統和3D-DNA行走器級聯放大過程。如圖1所示，裂解適配體S1通過生物素化固定在磁珠（MBs）上。在目標L-選擇素存在的情況下，裂解適配體S1和S2表現出選擇性結合能力。當引入Nt.BsmAI限制性內切酶時，S1的發夾結構沿核苷酸序列被特異性切割，釋放出S2。隨后，S2與下一個發夾結構結合，啟動3D-DNA行走器級聯反應并釋放大量激活劑DNA。最終，在CRISPR/Cas12a/crRNA復合物的作用下，激活劑DNA能夠被精確識別并結合，從而激活Cas12a的切割功能，無差別地分解所有單鏈DNA（F-Q），從而實現熒光放大。因此，利用這種生物傳感器作為介質，可以通過熒光信號響應定量和準確地監測目標L-選擇素。
化學與材料
鏈霉素修飾的磁珠購自Yeasen Biotechnology（中國上海）。L-選擇素來自Novus Biologicals（美國）。Nt.BsmAI和Lbacas12a酶購自New England BioLabs Ltd.（中國北京）。上海Sangon Biotechnology Co., Ltd.（中國上海）合成并修改了表S1中列出的DNA或RNA分子（見補充材料）。其他化學品購自Aladdin Co., Ltd.（中國上海）。所有其他試劑
利用雙信號放大器識別L-選擇素的熒光適配體機制
圖1展示了用于檢測L-選擇素存在的雙輸出放大熒光適配體的分解視圖。S1和S2是根據先前的研究發現設計的堿基序列[35]。在本研究中，使用了先前報道的L-選擇素適配體序列，實現了對L-選擇素的有效檢測。在酶輔助的DNA行走過程中，不同發夾結構的中心鏈（S1）
結論
總結來說，我們成功設計并實現了一種基于片段化適配體的3D-DNA行走器，與CRISPR-Cas系統集成，實現了L-選擇素的超靈敏檢測。該傳感器表現出優異的響應性，線性檢測范圍為10至1280 ng/mL，檢測限為0.45 ng/mL。該方法對L-選擇素具有顯著的選擇性，并已有效用于定量評估
CRediT作者貢獻聲明
李周：撰寫原始草稿、進行研究、數據整理。焦賢偉：驗證結果、軟件開發、正式分析。張玉婷：撰寫原始草稿、進行研究、數據整理。嚴長嶺：指導研究、資源調配、方法學設計、資金爭取、概念構思。
利益沖突聲明
作者聲明他們沒有已知的可能會影響本文工作的財務利益或個人關系。
致謝
本研究得到了河南省自然科學基金（編號：252300420250）的財政支持。
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